放射治療是前列腺癌（PCa）的主要治療方法，但一些患者會出現(xiàn)放療抵抗（RR）和復(fù)發(fā)。遺傳和表觀遺傳改變、腫瘤本身或腫瘤微環(huán)境可能影響放射治療的效果。更好地了解放療抵抗的潛在機制以開發(fā)新的治療方法至關(guān)重要，同時也需要敏感、穩(wěn)健且侵入性最小的工具來預(yù)測對放射治療（RT）的反應(yīng)。在該研究中，作者發(fā)現(xiàn)miR-200c-3p可以作為前列腺癌的無創(chuàng)預(yù)后生物標(biāo)志物并對其參與放療抵抗的機制進(jìn)行探討。文章于2024年10月發(fā)表在《Cell Death & Disease》，IF=8.1。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

1. miR-200c-3p在放療抵抗的細(xì)胞及其細(xì)胞外囊泡中下調(diào)

親本細(xì)胞（DU145和PC3）及其衍生的耐藥細(xì)胞（DU145 RR和PC3 RR）被暴露在0、2、4和6Gy的遞增劑量下，評估它們的輻射敏感性?？寺〈婊钋€確認(rèn)，與親本細(xì)胞相比，RR細(xì)胞具有顯著的放療抵抗（AUC DU154 RR 2.665 vs. DU145 2.164, RPF = 1.23），p < 0.01；以及AUC PC3 RR 1.698 vs. PC3 1.294, RPF = 1.31, p < 0.05)（圖1A）。接下來，研究者對這些細(xì)胞進(jìn)行了小RNA NGS，其中4個miRNA（表1，圖1B），在DU145和PC3 RR細(xì)胞及其親本對應(yīng)物之間表達(dá)差異顯著。hsa-miR-141-5p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-335-3p和hsa-miR-138-5p在PCa放療抵抗細(xì)胞中的表達(dá)與敏感細(xì)胞相比顯著下調(diào)。研究者通過RT-qPCR確認(rèn)了這些結(jié)果，除了hsa-miR-138-5p（圖1C）。

然后，研究者調(diào)查了是否可能在細(xì)胞外檢測到這些miRNA，以獲得非侵入性生物標(biāo)志物。通過Western blotting檢測DU145細(xì)胞EVs中外泌體標(biāo)記物的存在來評估EV純度（圖1D）。掃描透射電鏡和TRPS技術(shù)用于檢查小EVs的形態(tài)（圖1D），觀測值在典型小EVs的范圍內(nèi)。對這些小EVs進(jìn)行了小RNA NGS（圖1E）。與親本細(xì)胞相比，從RR細(xì)胞衍生的小EVs中也發(fā)現(xiàn)了miR-200c-3p的顯著下調(diào)。RT-qPCR驗證了miR-200c-3p下調(diào)（圖1F）?？傊?，這些結(jié)果表明miR-200c-3p是PCa化療抵抗的潛在標(biāo)志物。

圖1 miR-200c-3p 在放療抵抗的細(xì)胞及其細(xì)胞外囊泡中下調(diào)

2. MIR200C啟動子甲基化水平與放療抵抗相關(guān)

然后研究者研究了MIR200C啟動子的DNA甲基化狀態(tài)，以確定其表達(dá)下調(diào)是否是由于甲基化增加所致。焦磷酸測序發(fā)現(xiàn)MIR200C啟動子在DU145細(xì)胞中略微甲基化，平均啟動子范圍的甲基化水平為6.5%，而在DU145 RR細(xì)胞中高度甲基化，啟動子范圍的平均值為57.5%（圖2A）。而在獲得放療抵抗過程中的DU145細(xì)胞中，啟動子的整體甲基化水平為40.7%（圖2A）。

循環(huán)腫瘤DNA被用來評估微小殘留病變和治療反應(yīng)監(jiān)測的腫瘤特異性突變，但循環(huán)DNA的表觀遺傳特征，如甲基化模式，最近也被研究。因此，研究者使用甲基化敏感的qPCR方法測量了從DU145 RR和親本細(xì)胞提取的DNA中小EVs中MIR200C啟動子的DNA甲基化，與焦磷酸測序結(jié)果一致（圖2B）?？傮w而言，細(xì)胞外DNA中MIR200C啟動子的DNA甲基化水平可能是PCa放療抵抗的另一個潛在標(biāo)志物。

圖2 MIR200C啟動子甲基化水平與放療抵抗相關(guān)

3. 外泌體miR-200c-3p通過阻礙DNA修復(fù)恢復(fù)放療抵抗細(xì)胞的敏感性

由于在放療抵抗（RR）細(xì)胞中miR-200c-3p的表達(dá)受到抑制，研究者想知道這種miRNA是否僅僅是一個生物標(biāo)志物，或者它在獲得抗性方面是否發(fā)揮作用。因此，研究者調(diào)查了通過外源性添加miR-200c-3p是否能使RR細(xì)胞重新對輻射敏感，證實轉(zhuǎn)染miR-200c-3p的DU145 RR細(xì)胞在6Gy輻射后的放療抵抗顯著低于對照miRNA（miR-neg）的DU145 RR細(xì)胞（圖3A）。外源性miR-200c-3p還降低了細(xì)胞的存活率（圖2B），這表明這種miRNA促進(jìn)了放療抵抗細(xì)胞的死亡。

為了進(jìn)一步研究miR-200c-3p促進(jìn)DU145 RR細(xì)胞輻射敏感性的機制，研究者通過免疫熒光測量了輻射誘導(dǎo)的雙鏈斷裂（DSBs）的標(biāo)記物γ-H2AX的表達(dá)。在6Gy輻射后多達(dá)6小時，轉(zhuǎn)染miR-200c-3p的DU145 RR細(xì)胞和對照miRNA的細(xì)胞之間γ-H2AX焦點的數(shù)量非常接近。然而，在24小時后，轉(zhuǎn)染了miR-200c-3p的DU145 RR細(xì)胞中γ-H2AX焦點的數(shù)量顯著多于轉(zhuǎn)染了對照miRNA的細(xì)胞（圖3C，D）。與這些發(fā)現(xiàn)一致，研究者觀察到在轉(zhuǎn)染了miR-200c-3p的DU145 RR細(xì)胞中，DNA DSBs相關(guān)蛋白53BP1的水平比轉(zhuǎn)染了對照miRNA的細(xì)胞更高（圖3C，E）。綜合研究者的結(jié)果表明，miR-200c-3p減少了輻射后的DNA修復(fù)，可能通過這種方式使放療抵抗細(xì)胞重新敏感。

圖3 外泌體miR-200c-3p通過阻礙DNA修復(fù)恢復(fù)放療抵抗細(xì)胞的敏感性

4. miR-200c-3p通過下調(diào)HP1α阻礙DNA修復(fù)

為了確定miR-200c-3p在DNA修復(fù)中的靶點，研究者對DU145、DU145 RR以及轉(zhuǎn)染miR-200c-3p或?qū)φ誱iRNA的DU145 RR細(xì)胞進(jìn)行了3' RNA測序。發(fā)現(xiàn)在DU145 RR細(xì)胞和親本細(xì)胞之間有934個顯著差異表達(dá)的mRNA（圖4A），其中482個在DU145 RR細(xì)胞中下調(diào)，452個上調(diào)。通過分析轉(zhuǎn)染了miR-200c-3p和對照miRNA的DU145 RR細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，研究者鑒定出1114個差異表達(dá)的mRNA（圖4B），其中606個在轉(zhuǎn)染miR-200c-3p的細(xì)胞中上調(diào)，508個下調(diào)。KEGG通路分析顯示，與增殖相關(guān)的多種功能富集，如細(xì)胞周期通路（圖4C，D），以及DNA修復(fù)，如NHEJ通路。然后研究者將兩次轉(zhuǎn)錄組分析交叉對比，以識別在DU145 RR細(xì)胞相對于DU145細(xì)胞中上調(diào)，而在轉(zhuǎn)染miR-200c-3p的細(xì)胞中下調(diào)的mRNA，尋找已有功能驗證的miR-200c-3p靶基因。通過這種方式，研究者鑒定了19個mRNA作為DU145 RR細(xì)胞中上調(diào)的潛在miR-200c-3p靶基因（圖4E）。其中一個有趣的候選基因是CBX5（chromobox homolog 5），它編碼HP1α（Heterochromatin Protein 1 alpha）蛋白，該蛋白涉及異染色質(zhì)形成并與DNA修復(fù)機制密切相關(guān)。通過RT-qPCR驗證了CBX5的3' RNA測序結(jié)果后，研究者評估了miR-200c-3p對CBX5的直接靶向作用。共轉(zhuǎn)染miR-200c-3p與選定的CBX5 3'UTR序列下游的RenSP熒光素酶報告基因進(jìn)入HEK-293細(xì)胞（圖5A）。研究者發(fā)現(xiàn)miR-200c-3p直接結(jié)合到CBX5 3'UTR。引入3（mut1）到4（mut2）個錯配消除了這種相互作用（圖5A）。Western blot驗證了miR-200c-3p轉(zhuǎn)染對HP1α蛋白表達(dá)的影響，miR-200c-3p可以下調(diào)CBX5 mRNA導(dǎo)致其蛋白HP1α表達(dá)的減少（圖5B）。綜合這些數(shù)據(jù)，miR-200c-3p對放療抵抗的影響可能是通過調(diào)節(jié)HP1α表達(dá)介導(dǎo)的。

圖4 miR-200c-3p通過下調(diào)HP1α阻礙DNA修復(fù)

圖5

5. miR-200c-3p沉默是放療抵抗的常見機制

接下來，研究者想知道這種機制是否特異于PCa，通過測量其他接受放療的癌癥細(xì)胞系中miR-200c-3p的表達(dá)。在肺癌中，研究者發(fā)現(xiàn)5個細(xì)胞系（H838、ADCA211、ADCA233、ADCA72和A549）表現(xiàn)出miR-200c-3p表達(dá)水平較低，3個細(xì)胞系（H1975、H358和H1437）表達(dá)水平高，還有一個表達(dá)水平介于兩者之間（ADCA153）（圖6A）。健康細(xì)胞似乎顯示出miR-200c-3p表達(dá)水平較低。有趣的是，除了H1437在從單個細(xì)胞生長到克隆方面效率不高外，研究者觀察到miR-200c-3p表達(dá)與6Gy輻射后細(xì)胞存活相關(guān)（圖6B）。表達(dá)水平低的細(xì)胞系比表達(dá)水平高的miR-200c-3p的細(xì)胞系有顯著存活。研究者還評估了兩個乳腺癌細(xì)胞系之間的這種相關(guān)性，一個是已知對輻射有抗性的，即MDA-MB-231，另一個是已知對放療敏感的（MCF-7），并確認(rèn)在抗性細(xì)胞中miR-200c-3p表達(dá)顯著低于MCF-7細(xì)胞（圖6C）。此外，miR-200c-3p表達(dá)與其啟動子的DNA甲基化水平在肺癌和乳腺癌細(xì)胞系中強烈相關(guān)（圖6D）。

接下來，研究者調(diào)查了這些表達(dá)miR-200c-3p水平低的RR細(xì)胞是否可以通過外源性添加來重新對輻射敏感?？寺⌒纬勺C明轉(zhuǎn)染了miR-200c-3p的ADCA72和A549細(xì)胞在6Gy輻射后的放療抵抗顯著低于轉(zhuǎn)染了對照miRNA（miR-neg）的ADCA72和A549細(xì)胞（圖6E）。為了評估在這些細(xì)胞中CBX5是否也是miR-200c-3p的一個重要靶標(biāo)，研究者首先通過RT-qPCR評估了其表達(dá)。研究者觀察到在肺癌細(xì)胞系中miR-200c-3p表達(dá)與其潛在靶標(biāo)CBX5之間存在良好的相關(guān)性。接下來，研究者通過RT-qPCR測量了轉(zhuǎn)染miR-200c-3p或?qū)φ誱iRNA的ADCA72和A549細(xì)胞中CBX5的表達(dá)。在A549細(xì)胞系中，CBX5似乎不是miR-200c-3p的主要靶標(biāo)，而在ADCA72細(xì)胞系中，研究者觀察到當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-200c-3p與miR-neg相比時，CBX5表達(dá)的下降與DU145 RR細(xì)胞中觀察到的相同（圖6F）。研究者認(rèn)為這些細(xì)胞系之間涉及抗性的機制是共同的。研究者得出結(jié)論，miR-200c-3p沉默是不同類型癌細(xì)胞中放療抵抗的共同機制。

圖6 miR-200c-3p沉默是放療抵抗的常見機制

結(jié)論

本文的結(jié)論指出，miR-200c-3p在前列腺癌中的表達(dá)下調(diào)與放療抵抗相關(guān)，并且其通過靶向HP1α來延遲DNA修復(fù)，從而增強癌細(xì)胞對放射治療的敏感性。此外，miR-200c-3p的沉默及其啟動子的甲基化在多種癌癥中是放療抵抗的共同機制，使其成為一個有潛力的生物標(biāo)志物，用于預(yù)測和監(jiān)測放射治療的反應(yīng)。

實驗方法

KEGG通路分析、靶基因預(yù)測與分析、小RNA測序、3' RNA測序、DNA甲基化分析、熒光素酶報告基因分析、Western Blot、RT-qPCR、細(xì)胞培養(yǎng)與輻射處理、克隆形成實驗、細(xì)胞外囊泡（EVs）的純化和定量、細(xì)胞活性實驗、免疫熒光實驗

參考文獻(xiàn)

Seok, H.J., Choi, J.Y., Lee, D.H. et al. Atomoxetine suppresses radioresistance in glioblastoma via circATIC/miR-520d-5p/Notch2-Hey1 axis. Cell Commun Signal 22, 532 (2024). https://doi.org/10.1186/s12964-024-01915-