半乳糖凝集素-9是多種病理生理過程的多方面調節因子，以上下文依賴的方式發揮積極或消極的作用。在這里，作者闡明了半乳糖凝集素-9在腦腫瘤微環境中對髓系細胞的獨特功能特性。半凝集素-9在腫瘤浸潤細胞的小膠質細胞和巨噬細胞中高表達。在原代膠質細胞中，半乳糖凝集素-9的表達和分泌均受腫瘤的影響。對人類膠質母細胞瘤大量RNA測序數據集和來自小鼠膠質瘤模型的單細胞RNA測序數據集的分析揭示了半乳糖凝集素-9表達與膠質細胞活化之間的相關性。在腦腫瘤微環境中，半凝集素-9高的小膠質細胞亞群在功能上不同于半凝集素-9陰性/低的小膠質細胞亞群。高半乳糖凝集素-9的小膠質細胞表現出炎癥激活和更高的細胞死亡率，而低半乳糖凝集素-9的小膠質細胞對腦腫瘤細胞表現出優越的吞噬能力。在小鼠膠質瘤模型中，阻斷半乳糖凝集素-9抑制腫瘤生長并改變膠質細胞和T細胞的活性。這些發現表明骨髓細胞上的半乳糖凝集素-9是一種免疫調節劑，也是腦腫瘤的推定治療靶點。該文章于2024年11月發表在《cancer research》，IF：14.2。

摘要圖：

主要研究結果：

1. 半乳糖凝集素-9在顱內小鼠腫瘤模型的荷瘤同側半球高表達

半乳糖凝集素-9似乎作為病理生理過程的多方面調節因子，以上下文依賴的方式發揮積極或消極的作用。為了更好地了解腦TME的免疫景觀，作者使用顱內GL26小鼠膠質瘤模型研究了半乳糖凝集素-9的表達特征。WB顯示，與對側半球相比，雌性和雄性小鼠的同側半球中半乳糖凝集素-9的表達明顯更高（圖1A）。在使用B35細胞的大鼠模型中觀察到類似的結果（圖1B和C）。免疫組織化學顯示，半乳糖凝集素-9在同側區域的表達明顯高于對側區域（圖1D）。

接下來，作者使用表達EGFP的GL26小鼠研究了哪些細胞類型表達半乳糖凝集素-9。免疫組化顯示，半乳糖凝集素-9在EGFP陽性的腫瘤細胞和腫瘤周圍細胞上均有表達（圖1E）。如圖1F和G所示，半乳糖凝集素-9與CD3+ T細胞、IBA-1 +小膠質細胞和GFAP+星形膠質細胞共定位，在腫瘤邊緣（即腫瘤病變與正常組織之間的界面）比腫瘤核心更明顯。然而，作者沒有在new +神經元中檢測到半乳糖凝集素-9。為了驗證這些發現，作者檢測了GL26小鼠腫瘤浸潤免疫細胞中半乳糖凝集素-9的水平。流式細胞術顯示，與對側腫瘤區域相比，同側腫瘤區域的小膠質細胞（CD45midCD11b+）、巨噬細胞（CD45highCD11b+）和淋巴細胞（CD45highCD11b -）中的半凝集素-9水平顯著增強（圖1H）。這些結果表明半乳糖凝集素-9可能在腦TME內腫瘤周圍免疫細胞中發揮特定作用。

2. 小膠質細胞半凝集素-9的表達在腦腫瘤中發生改變，并與炎癥事件有關

小膠質細胞是至關重要的腦駐留前哨細胞，在第一道防線中起著至關重要的作用，腦腫瘤腫塊通常由高達40%的髓系細胞組成，包括小膠質細胞。因此，作者主要關注小膠質細胞中的半凝集素-9，研究了小膠質細胞半凝集素-9的表達是否可以被腦腫瘤調節。半乳糖凝集素-9的轉錄物和蛋白水平在暴露于腦腫瘤CMs的原代膠質細胞中明顯升高。隨著時間的推移，在初級小膠質細胞中觀察到這種增加（圖2A）。FACS和免疫細胞化學分析進一步顯示，與PACM相比，gl26cm處理的小膠質細胞細胞質和細胞表面半乳糖凝集素-9水平顯著升高（圖2B）。原代小膠質細胞與GL26-EGFP細胞共培養也導致小膠質細胞半乳糖凝集素-9的升高（圖2C）。此外，間接共培養增強了半乳糖凝集素-9的表達和Ki-67+增殖小膠質細胞的比例。然后，作者監測原代膠質細胞分泌半乳糖凝集素-9，發現gl26cm處理的膠質細胞比PACM處理的膠質細胞分泌更多（圖2D），表明腫瘤源性因子以旁分泌模式影響膠質半凝集素-9。

圖1 半凝集素-9在顱內腫瘤模型的同側半球表達升高

據報道，分泌的半乳糖凝集素-9在某些病理條件下作為一種損傷相關分子模式（DAMP）。為了評估半乳糖凝集素-9在腦TME中的功能特性，作者使用重組半乳糖凝集素-9（rmGal-9）檢測了外源性半乳糖凝集素-9在免疫和炎癥反應中的作用。用rmGal-9治療小膠質細胞顯著增加了半乳糖凝集素-9的轉錄物和蛋白水平，以及白細胞介素（IL）-1和IL-6等炎癥細胞因子（圖2E-G）。FACS分析顯示rmGal-9升高炎癥相關分子的水平，包括toll樣受體（TLR）-2和程序性死亡配體1 （PD-L1，圖2H）。

圖2 小膠質細胞半凝集素-9在腦腫瘤中表達上調

這些發現促使作者研究腦TME中半乳糖凝集素-9表達與神經膠質活化之間的關系。作者分析了最初由Ochocka等人獲得的小鼠GL261膠質瘤CD11b+細胞的scRNA-seq數據。與對照組相比，腫瘤組織中的小膠質細胞和膠質瘤相關巨噬細胞的Lgals9表達更高。使用MG評分，定義為小膠質細胞激活特征基因- TMEM119， P2ry12， Cx3cr1， Olfml3， Sparc和Gpr34，作者發現Lgals9水平與小膠質細胞簇中的小膠質細胞激活之間存在顯著相關性。同樣，TCGA-GBM分析顯示Lgals9表達與TMEM119之間存在強正相關（圖2I）。綜上所述，這些結果表明神經膠質半乳糖凝集素-9的表達和分泌受到腦腫瘤的影響，半乳糖凝集素-9在腦TME內腫瘤暴露的神經膠質中誘導炎癥反應。

3. 半凝集素-9高的小膠質細胞比半凝集素-9陰性/低亞群表達更高水平的炎癥介質

鑒于上述發現，作者試圖探索腦TME中半乳糖凝集素-9高表達和負/低表達的膠質細胞的功能特征。作者首先檢查了半乳糖凝集素-9高和半乳糖凝集素-9陰性/低的小膠質細胞中代表性炎癥相關分子的水平。與上述結果一致，在CD11b+半凝集素-9高的小膠質細胞中，TLR-2、TLR-4和PD-L1的水平明顯高于CD11b+半凝集素-9陰性/低的小膠質細胞（圖3A）。相反，半乳糖凝集素-9高和半乳糖凝集素-9陰性/低小膠質細胞亞群的TIM-3水平無顯著差異。接下來，作者分析了gl26cm處理的TLR-2高表達小膠質細胞和PD-L1高表達小膠質細胞中半乳糖凝集素-9的水平。如圖3B和C所示，與模擬處理的對照組相比，GL26CM顯著增加了TLR-2高水平的小膠質細胞的比例，并且這些TLR-2高水平的細胞比TLR-2陰性/低水平的小膠質細胞表現出更高的半凝集素-9水平。同樣，gl26cm誘導的高PD-L1小膠質細胞比暴露于GL26CM的低PD-L1亞群顯示出更高的半乳糖凝集素-9水平（圖3D和E）。這些發現進一步支持了半乳糖凝集素-9的表達與腦TME中小膠質細胞的炎癥特性密切相關。

4. 半凝集素-9高的小膠質細胞比半凝集素-9陰性/低的小膠質細胞有更高的細胞死亡率

據報道，半乳糖凝集素-9可觸發T細胞凋亡，而半乳糖凝集素-9相關的細胞凋亡與幾種自身免疫性疾病有關。因此，作者詢問半乳糖凝集素-9是否有助于腦TME中的小膠質細胞死亡。作者首先研究了分泌的半凝集素-9是否會影響神經膠質細胞的死亡。rmGal-9處理導致小膠質細胞增殖明顯減少，Annexin-V + PI+凋亡細胞顯著增加（圖4A）。然后，作者探討了rmGal-9是否與caspase-1激活介導的炎癥相關細胞死亡有關。FAM-FLICA和FVS-780染色顯示，rmGal-9顯著升高活細胞中FLICA+活性caspase-1，顯著增加小膠質細胞中FLICA+ FVS-780+炎性細胞死亡（圖4B）。WB和免疫細胞化學染色進一步表明，與模擬處理的對照組相比，rmgal -9處理的膠質細胞表現出氣皮素-d（GSDMD）的大幅上調，GSDMD是炎癥性半胱天蛋白酶的生理底物和熱相關調節因子，其活性裂解形式（圖4C）。這些結果表明，細胞外半乳糖凝集素-9可能引發細胞凋亡和炎癥相關的膠質細胞死亡。

圖3 半凝集素-9影響神經膠質細胞的炎癥免疫反應

圖4 小膠質半凝集素-9有助于腦TME中的細胞死亡

接下來，作者比較了半凝集素-9高和半凝集素-9陰性/低小膠質細胞亞群中凋亡細胞的程度。值得注意的是，暴露于GL26CM后，半凝集素-9高的小膠質細胞中凋亡細胞顯著增加，但在半凝集素-9陰性/低的小膠質細胞中未檢測到這種增加（圖4D）。在與GL26-EGFP細胞共培養的原代小膠質細胞中觀察到類似的結果（圖4E）。為了驗證這些結果，作者研究了半乳糖凝集素-9阻斷是否可以減少腫瘤暴露的半乳糖凝集素-9高的小膠質細胞的細胞死亡。如圖4F所示，半乳糖凝集素-9阻斷顯著降低了與GL26-EGFP細胞共培養的半乳糖凝集素-9高含量小膠質細胞的死亡細胞百分比，而半乳糖凝集素-9陰性/低含量小膠質細胞沒有明顯變化（圖4F）。總的來說，這些結果表明半乳糖凝集素-9高的小膠質細胞比半乳糖凝集素-9陰性/低的小膠質細胞更容易發生細胞死亡。

5. 半凝集素-9陰性/低的小膠質細胞比半凝集素-9高的小膠質細胞表現出更強的吞噬能力

吞噬作用是中樞神經系統內小膠質細胞的基本功能。因此，作者評估了半乳糖凝集素-9高和半乳糖凝集素-9陰性/低的小膠質細胞對GL26-EGFP細胞的吞噬活性。有趣的是，半乳糖凝集素-9陰性/低的小膠質細胞比半乳糖凝集素-9高的小膠質細胞更有效地吞噬EGFP陽性的腫瘤細胞（圖5A）。為了進一步評估半乳糖凝集素-9與小膠質細胞吞噬能力之間的相關性，作者檢測了半乳糖凝集素-9表達與代表性抗吞噬分子如PD-1和信號調節蛋白（SIRP）-α的關系。如圖5B所示，與PD-1高的小膠質細胞相比，PD-1陰性/低的小膠質細胞對腫瘤細胞的吞噬活性更高。然后作者比較了半乳糖凝集素-9高和半乳糖凝集素-9陰性/低的小膠質細胞中SIRP-α和PD-1的水平。與圖5A一致，在與GL26細胞共培養的原代膠質細胞中，半乳糖凝集素-9高的小膠質細胞的SIRP-α和PD-1水平高于半乳糖凝集素-9陰性/低的小膠質細胞（圖5C）。為了證實這些結果，作者研究了gl26小鼠腫瘤浸潤細胞中SIRP-α和PD-1的水平。半乳糖凝集素-9高cd45midcd11b +的小膠質細胞與半乳糖凝集素-9陰性/低的小膠質細胞相比，顯示出更高水平的抗吞噬分子SIRP-α和PD-1（圖5D）。在CD45^highCD11b+巨噬細胞中觀察到類似的結果（圖5E）。

接下來，作者研究了半乳糖凝集素-9是否參與與PD-1相關的吞噬作用。為了解決這個問題，作者根據PD-1和半乳糖凝集素-9的表達將CD45midCD11b+小膠質細胞分為四個不同的亞群：PD-1 +Gal-9 -、PD-1 +Gal-9 +、PD-1 - Gal-9 +和PD-1-Gal-9-。然后作者用流式細胞術比較了小膠質細胞亞群中SIRP-α的水平。PD-1 +Gal-9 -和PD-1 +Gal-9 +小膠質細胞在同側腦半球的比例明顯高于對側腦半球。這些亞群也表現出比其他人群更高的SIRP-α百分比（圖5F）。值得注意的是，與PD-1 +Gal-9 -和PD-1 +Gal-9 +小膠質細胞相比，PD-Gal-9 -小膠質細胞中SIRP-α的百分比顯著降低。同樣，PD-1 +Gal-9 -和PD-1 +Gal-9+小膠質細胞的EGFP+細胞被吞噬的頻率較低，而PD-1 - Gal-9 -小膠質細胞的吞噬能力比其他亞群更強（圖5G）。

圖5 半凝集素-9陰性/低的小膠質細胞比半凝集素-9高的小膠質細胞表現出更強的吞噬能力

然后作者探索半乳糖凝集素-9阻斷是否會影響小膠質細胞的吞噬活性。與igg處理的小膠質細胞相比，抗半乳糖凝集素-9抗體處理的原代小膠質細胞顯示出更高的頭部攝取百分比。此外，在GL26-EGFP細胞培養的原代小膠質細胞中，半凝集素-9阻斷可顯著降低SIRP-α和PD-1的水平（圖5H）。因此，作者研究了半乳糖凝集素-9和CD47的共同阻斷是否會影響小膠質細胞腫瘤的吞噬。在原代膠質細胞和GL26-EGFP細胞共培養中，與單獨使用任一抗體相比，抗半乳糖凝集素-9和抗cd47抗體共同處理顯著增強了吞噬能力。同樣，當原代膠質細胞在抗CD47抗體存在下與GL26-EGFP細胞共培養之前，預先暴露于具有抗半乳糖凝集素-9或同型抗體的GL26CM時，雙半乳糖凝集素-9和CD47抑制比單次治療顯著增強了小膠質細胞對腫瘤細胞的吞噬作用（圖5I）。總之，這些結果支持半乳糖凝集素-9可能有助于腦TME內初級膠質細胞的抗吞噬活性。

6. 阻斷半乳糖凝集素-9影響腫瘤大小和腦TME中髓細胞和T細胞的活性

以上結果促使作者進一步研究抗半乳糖凝集素-9抗體對腫瘤生長的影響。GL26細胞移植7天后，腹腔注射200 μg阻斷抗體或等量對照IgG；每3天重復一次，持續2周。與IgG對照組相比，半乳糖凝集素-9阻斷顯著降低了女性和男性腫瘤模型的腫瘤大小，延長了生存期（圖6A和B；補充圖S16）。腫瘤浸潤細胞的FACS分析顯示，半乳糖凝集素-9阻斷導致CD45midCD11b+小膠質細胞和CD45highCD11b+巨噬細胞中PD-1水平降低（圖6C和D）。此外，與igg處理小鼠相比，抗半乳糖凝集素-9處理小鼠的腫瘤內PD-1 +CD8+ T細胞表現出更高的TCF-1表達，TCF-1是CD8+ T細胞效應功能的關鍵轉錄因子（圖6E）。

先天免疫細胞與T細胞相互作用并觸發細胞毒性CD8+ T細胞的激活。因此，作者研究了半乳糖凝集素-9阻斷是否會影響膠質細胞和T細胞的相互作用。將原代膠質細胞模擬處理或用GL26CM處理24小時，然后在抗半乳糖凝集素-9抗體或IgG存在下與CD8+ T細胞共培養48小時。流式細胞術顯示，抗半乳糖凝集素-9抗體與GL26CM暴露的膠質細胞共培養的PD-1 +CD8+ T細胞中TCF-1水平顯著升高（圖6F）。ELISA進一步顯示，與gl26cm處理的膠質細胞共培養時，抗半乳糖凝集素-9抗體存在時，CD8+ T細胞產生的IFN-α比對照IgG增強（圖6G）。與對照IgG相比，半凝集素-9阻斷也顯著增加了CD107a +脫顆粒CD8+ T細胞的百分比（圖6H）。然而，在單獨培養的T細胞中，抗半乳糖凝集素-9抗體并不直接影響CD8+ T細胞的活性，包括增殖和細胞因子的產生。這些結果表明，在膠質細胞存在的情況下，半乳糖凝集素-9阻斷會影響CD8+ T細胞的活性。

圖6 半凝集素-9阻斷劑在顱內腫瘤模型中顯示抗腫瘤作用

基于以上結果，作者進一步研究抗半乳糖凝集素-9和抗PD -1抗體對腫瘤生長的聯合作用。如圖6I所示，與IgG對照相比，抗半乳糖凝集素-9或抗PD -1抗體均可顯著降低腫瘤體積。值得注意的是，用這兩種抗體治療導致腫瘤大小更明顯的縮小。這些結果進一步證實了半凝集素-9阻斷在顱內腦腫瘤模型中的作用。

7. Hif-2α對半乳糖凝集素-9的表達和腦TME內腫瘤的生長至關重要

作者接下來的問題是半乳糖凝集素-9的表達是如何在腦TME的膠質細胞中被調節的。鑒于小鼠半乳糖凝集素-9基因的啟動子區域包含2個假定的缺氧反應元件（HRE；5 ' -（A/G）CGT（G/C）（G/C）-3 '）在其啟動子區域與缺氧誘導因子（Hif）（33）結合（Supplementary Fig. S20A），作者研究了半凝集素-9在腦TME中的表達是否受到Hif的調節。使用吡莫硝唑（hypoxyprobe-1），一種缺氧標志物，作者發現半乳糖凝集素-9在同側半球腫瘤邊緣的吡莫硝唑染色區域表達更為普遍（圖7A），與上述結果一致，免疫細胞化學和流式細胞術顯示，在1%氧氣缺氧條件下，小膠質細胞中半凝集素-9的表達明顯高于20%氧氣正常缺氧條件下的小膠質細胞（圖7B和C）。

為了進一步研究小膠質細胞半凝集素-9的表達是否受到缺氧的主要調節因子hif的調節，作者使用了髓細胞特異性Hif-1α-或Hif-2α-缺陷小鼠。作者收集gl26接種的LysM-Cre、LysM-Cre+/+/Hif-1α f/f和LysM-Cre+/+/Hif-2α f/f小鼠腦組織，比較半凝集素-9水平。在LysM-Cre和LysM-Cre+/+/Hif-1α f/f小鼠的組織中，半凝集素-9在同側區域的表達明顯高于對側區域（圖7D）。值得注意的是，Western blotting和免疫熒光染色顯示，與LysM-Cre小鼠相比，LysM-Cre+/+/Hif-2α f/f小鼠同側組織中半乳糖凝集素-9水平明顯降低（圖7D）。流式細胞術進一步顯示，在LysM-Cre小鼠中，腫瘤浸潤性CD45midCD11b+小膠質細胞上的半凝集素-9表達顯著升高，但在LysM-Cre+/+/Hif-2α f/f小鼠中，這種升高明顯降低（圖7E）。此外，MRI和免疫組織化學分析顯示，雄性和雌性LysM-Cre+/+/Hif-2α f/f小鼠的腫瘤體積明顯小于LysM-Cre小鼠（圖7F）

為了進一步證明Hif-2α依賴性半凝集素-9在小膠質細胞中的表達，作者使用原代膠質細胞進行了體外實驗。與LysM-Cre對照小鼠相比，LysM-Cre+/+/Hif-2α f/f小鼠gl26cm暴露的膠質細胞中半乳糖凝集素-9水平明顯降低（圖7G）。此外，GL26CM對LysM-Cre小鼠小膠質細胞中半乳糖凝集素-9和PD-L1轉錄物的上調在LysM-Cre+/+/Hif-2α f/f小鼠中未見（圖7H）。與小膠質細胞類似，敲除星形膠質細胞中的Hif-2α可顯著抑制半乳糖凝集素-9的表達。此外，即使在正常條件下，GL26CM和rmGal-9也能提高Hif-2α轉錄水平。這些數據強烈表明，Hif-2α在調節腦TME內膠質細胞的半乳糖凝集素-9中起著重要作用。

圖7 Hif-2α調控腦TME中半凝集素-9的表達

結論：

基于這些臨床相關結果和作者的發現，作者提出半乳糖凝集素-9作為小膠質細胞的關鍵免疫檢查點分子，影響腦TME的免疫和炎癥反應。這個研究結果表明，將半乳糖凝集素-9靶向于髓系細胞可能是一種有希望的策略，可以改善基于icb的免疫治療，克服腦腫瘤的治療無反應性和耐藥性。

實驗方法：

顱內腦腫瘤模型，腦浸潤細胞的分離，原代小膠質細胞的培養，條件培養基的制備，免疫印跡和RT-PCR分析，免疫熒光成像，流式細胞術，程序性細胞死亡實驗，膠質細胞與CD8+ T細胞共培養實驗

參考文獻：

Chanju Lee, Dahee Yu, Hyung-Seok Kim, Ki Sun Kim, Chi Young Chang, Hee Jung Yoon, Su Bin Won, Dae Yeon Kim, Eun Ah Goh, Yong Sun Lee, Jong-Bae Park, Sang Soo Kim, Eun Jung Park; Galectin-9 Mediates the Functions of Microglia in the Hypoxic Brain Tumor Microenvironment. Cancer Res 15 November 2024; 84 (22): 3788–3802. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-23-3878