最近的觀察顯示，H3K27cr在結直腸癌（CRC）組織中上調；然而，根本原因仍然難以捉摸。本研究旨在探討H3K27cr上調的機制及其在CRC轉移中的作用。臨床上，我們的研究結果表明，H3K27cr是區分結直腸癌組織與健康對照的高度準確的診斷標志物。升高的LINC00887和H3K27cr水平與CRC患者較差的預后相關。在功能上，LINC00887和H3K27cr促進了CRC細胞的遷移和侵襲。機制上，LINC00887與SIRT3蛋白相互作用。LINC00887過表達阻斷了GCN5啟動子內SIRT3的富集，從而使該區域的H3K27ac水平升高，而H3K27cr水平未升高，進而激活GCN5的表達。這種激活提高了H3K27cr的總體水平，促進了GCN5、H3K27cr和YEATS2在ETS1啟動子內的富集，激活了ETS1的轉錄，最終促進了CRC的轉移。體內研究表明，抑制LINC00887可抑制結直腸癌轉移，但當小鼠接受NaCr治療時，這種抑制作用被消除?？傊?，我們的研究結果證實了H3K27cr在結直腸癌個體中的診斷生物標志物潛力，并提出了一個功能模型來闡明LINC00887通過提高H3K27cr水平參與促進結直腸癌轉移。本文于2024年10月發表于“Cell Death and Disease”（IF=8.1）上。

技術路線：

結果：

1）H3K27cr水平高與預后不良相關

我們檢測了97名結直腸癌患者癌組織及58名患者癌旁組織中H3K27cr的水平。結果顯示，癌組織的H3K27cr水平高于正常組織（圖1A-C）。我們研究了H3K27cr在區分結直腸癌組織與健康對照組中的潛在診斷價值。值得注意的是，ROC曲線分析顯示曲線下面積（AUC）值為0.9（圖1D）。此外，在我們之前的研究隊列中重復了這一分析，得到的AUC值為0.81（圖1E）。我們還評估了H3K27cr在區分遠處轉移的結直腸癌患者與無遠處轉移患者中的診斷價值，得到的AUC值為0.84（圖1F）。進一步地，H3K27cr顯示出區分轉移部位與原發結直腸癌組織的能力，AUC值為0.75（圖1G）。特別值得注意的是，在伴有淋巴結侵犯的結直腸癌患者中，H3K27cr水平升高者的預后較差（圖1H）。

2）LINC00887提高H3K27cr水平

接下來，我們研究了lncRNAs是否調節H3K27cr修飾。我們從TCGA數據集中識別了結腸腺癌（COAD）中差異表達的基因，或者使用激光顯微切割技術獲得的結直腸癌患者的上皮細胞中的差異表達基因（GSE15960）。研究發現，在COAD組織和從結直腸癌細胞衍生的上皮細胞中分別有1573和4241個基因差異表達。將這兩個結果結合起來，發現了298個差異表達的基因，包括五個lncRNAs（圖2A）。使用GSEA分析檢查這五個lncRNAs與具有被H3K27cr占據的啟動子的基因之間的關聯。這些發現表明，具有被H3K27cr占據的啟動子的基因在上皮細胞或COAD組織中高表達LINC00887的情況下顯著富集（圖2B, C）。隨后，對來自單細胞轉錄譜的上皮細胞進行了類似分析。檢查了來自GSE110009數據集的總共8083個細胞，識別出15個不同的細胞亞型（圖2D）。具有被H3K27cr占據的啟動子的基因在上皮細胞和Th0細胞中富集（圖2E）。GSEA結果顯示，在上皮細胞中高表達LINC00887的情況下，具有被H3K27cr占據的啟動子的基因顯著富集，但在Th0細胞中則不然（圖2F）。接下來，我們通過qRT-PCR檢測伴有淋巴結侵犯的結直腸癌患者中LINC00887的表達。結果表明，高LINC00887表達與預后不良顯著相關（圖2G）。Spearman相關性分析顯示LINC00887與H3K27cr水平之間存在正相關關系（圖2H）。LINC00887過表達增加了H3K27cr水平（圖2I）。相反，短暫和穩定的LINC00887敲減產生了相反的效果（圖2J, K）。這些發現為LINC00887促進H3K27cr水平提供了證據。

3）LINC00887通過誘導GCN5表達提高H3K27cr水平

接下來，我們研究了LINC00887增加H3K27cr的機制。GCN5在結直腸癌組織中顯著升高。研究發現，穩定和短暫的敲低LINC00887會降低GCN5的表達，而過表達LINC00887會提高GCN5的表達水平（圖3A-C）。此外，一項涉及LINC00887質粒和siGCN5共轉染的拯救實驗恢復了H3K27cr水平（圖3D）。隨后，我們研究了GCN5啟動子組蛋白H3K27修飾的改變。結果顯示，LINC00887過表達上調了該區域的H3K27ac水平，但沒有上調H3K27cr水平（圖3E）。為了研究LINC00887影響GCN5啟動子上H3K27ac富集的分子機制，我們初步檢測了LINC00887在CRC細胞中的定位，揭示了主要的核定位。因此，我們假設LINC00887是否通過與乙?；嚓P酶的相互作用調控GCN5啟動子上H3K27ac的富集。隨后，進行RIP實驗以鑒定與LINC00887相互作用的蛋白。結果顯示SIRT3和LINC00887之間存在顯著的相互作用（圖3F）。這種相互作用通過RNA-FISH實驗進一步證實，顯示它們在細胞核中共定位（圖3G）。我們還觀察到，LINC00887過表達降低了GCN5啟動子中SIRT3的富集，而LINC00887敲低則增加（圖3H）。這些發現表明LINC00887與SIRT3相互作用。它的過表達阻礙了SIRT3與GCN5啟動子的結合，使該區域的H3K27ac水平升高，激活GCN5轉錄，最終使H3K27cr水平升高。

4）H3K27cr調節CRC組織上皮細胞的細胞粘附

我們研究了H3K27cr在調節侵襲中的作用機制。我們用NaCr處理結直腸癌細胞，并觀察到侵襲和遷移能力的增強（圖4A, B）。隨后，我們分析了Liao等人報道的具有被H3K27cr占據的啟動子的基因的功能通路。共富集了20個通路，包括細胞間粘附通路。接著，進行了單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析，以評估這些20個通路在特定細胞類型中的存在情況。在GSE163974數據集中分析了總共1,688個細胞，識別出八個不同的細胞亞型（圖4C）。通過比較不同細胞亞型中的20個通路，觀察到細胞間粘附通路在來自結直腸癌組織的上皮細胞中特異性富集（圖4D）。這一結果在之前分析過的GSE221575數據集中得到了進一步證實（圖4E）。用NaCr處理的結直腸癌細胞減少了E-鈣粘蛋白，同時誘導了N-鈣粘蛋白的表達（圖4F, G）。這一發現暗示H3K27cr可能通過其對細胞粘附的影響，在結直腸癌轉移中發揮調節作用。

5）LINC00887促進結直腸癌細胞的侵襲和遷移

考慮到LINC00887對H3K27cr水平的促進作用，我們研究了LINC00887對加速侵襲和遷移的影響。研究結果顯示，LINC00887過表達增加了CRC細胞的侵襲和遷移水平，而立即和持續敲低LINC00887可降低這些水平（圖5A-C）。此外，立即和持續敲低LINC00887可上調E-cadherin的表達，下調N-cadherin和vimentin的表達，而過表達LINC00887則對這些標記物具有相反的作用（圖5D-F）。這些結果表明，LINC00887促進了CRC細胞的侵襲和遷移。

6）LINC00887通過H3K27cr介導的細胞粘附分子促進侵襲和遷移

我們研究了LINC00887是否通過H3K27cr調節侵襲和遷移。我們在HCT116細胞中進行了拯救實驗，實驗中轉染了siLINC00887并使用了10mM NaCr處理。結果顯示，NaCr處理恢復H3K27cr水平后，侵襲和遷移水平以及E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白和波形蛋白的水平也得到了恢復（圖6A, B）。此外，拯救實驗表明，GCN5敲減恢復了LINC00887調節的E-鈣粘蛋白和波形蛋白水平（圖6C），這表明LINC00887通過GCN5/H3K27cr途徑調節結直腸細胞的侵襲和遷移。接下來，使用WGCNA在來自正常和結直腸癌組織的上皮細胞中識別了91個共表達模塊（圖6D）。在這些模塊中，有8個模塊在結直腸癌來源的上皮細胞中表達降低，而16個模塊表達增加（圖6E）。有10個模塊中的基因與EMT通路基因顯著相關。其中兩個模塊與602個基因表現出強烈的關聯（圖6F）。我們對GSE110009數據庫中602個以上的單細胞基因進行了mapping分析。分析顯示，它們在正常、結直腸癌和轉移組織的B細胞和上皮細胞中顯著富集（圖6G， H）。隨后，對這602個基因的生物學途徑進行了注釋。結果表明，83條通路至少包含5個基因。在上皮細胞中比較這83種通路發現，CAMs在來自轉移組織的上皮細胞中表現出特異性富集（圖6I）。值得注意的是，這一結果在之前分析過的GSE225857數據集中得到了證實（圖6J）。這些發現表明，LINC00887通過H3K27cr調節轉移組織上皮細胞的CAMs通路。

7）LINC00887通過提高YEATS2的募集來促進ETS1的表達

ETS1調節CAMs基因的表達。我們接下來研究了LINC00887是否影響ETS1的表達。我們的觀察發現，LINC00887過表達增加了ETS1的水平，而LINC00887敲減則表現出相反的效果（圖7A–D）。此外，通過共轉染HCT116細胞LINC00887質粒和siETS1進行了拯救實驗，發現ETS1敲減恢復了侵襲和遷移的水平，以及E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達（圖7E, F），這表明LINC00887通過ETS1調節轉移。接下來，我們研究了LINC00887對ETS1的調控機制。我們發現ETS1表達依賴于NaCr濃度，隨著NaCr濃度的增加，ETS1表達也增加（圖7G）。因此，對ETS1啟動子的分析顯示，LINC00887過表達增加了GCN5、YEATS2和H3K27cr在這一區域的富集。相反，LINC00887敲減產生了相反的效果（圖7H–J）。拯救實驗顯示，GCN5或YEATS2敲減恢復了LINC00887調節的ETS1表達（圖7K）。總的來說，結果表明LINC00887增強了ETS1啟動子中GCN5、H3K27cr和YEATS2的富集，激活了ETS1表達。

8）體內抑制LINC00887可抑制結直腸癌轉移

最后，我們在體內研究了LINC00887在調節CRC轉移中的作用（圖8A）。結果發現，抑制LINC00887能有效抑制HCT116細胞的轉移。然而，當用NaCr處理小鼠時，這種抑制作用被消除（圖8B， C）。此外，觀察到抑制LINC00887降低了GCN5， H3K27cr和vimentin水平。用NaCr處理后，這些減少被逆轉（圖8D， E）?？傊覀兊难芯拷Y果表明，LINC00887和SIRT3之間的相互作用使SIRT3從GCN5啟動子中移位。這種位移增加了GCN5啟動子處的H3K27ac水平，激活了GCN5的表達，提高了H3K27cr的總體水平。因此，GCN5向ETS1啟動子的募集增強，提高了該區域的H3K27cr水平。這種增強的富集進一步促進了YEATS2的募集，增加了ETS1的表達和CRC轉移（圖8F）。

結論：

LINC00887過表達促進GCN5募集到ETS1啟動子，導致H3K27cr富集并被YEATS2識別。最終，這一事件級聯導致ETS1轉錄增強和CRC轉移。這些發現支持了LINC00887和H3K27cr在促進結直腸癌轉移中的作用。

實驗方法：

單細胞測序，Western blotting，qRT-PCR，Transwell，ChIP-seq，ChIP-qPCR，RIP，FISH，IHC。

參考文獻：

Liao M, Zheng W, Wang Y, Li M, Sun X, Liu N, Yao J, Dong F, Wang Q, Ma Y, Mou J. LINC00887 promotes GCN5-dependent H3K27cr level and CRC metastasis via recruitment of YEATS2 and enhancing ETS1 expression. Cell Death Dis. 2024 Sep 30;15(9):711. doi: 10.1038/s41419-024-07091-w.