光動(dòng)力治療（Photodynamic therapy, PDT）是對(duì)抗耐藥性癌癥的一種有前景的治療手段。癌細(xì)胞中的脂滴在細(xì)胞代謝和信號(hào)傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用，且與多種抗癌藥物的敏感性有關(guān)。鐵死亡是一種由脂質(zhì)過氧化物積累引起的細(xì)胞死亡方式，而焦亡則是一種通過炎癥小體激活的細(xì)胞死亡方式。該研究開發(fā)一種新型的聚集誘導(dǎo)發(fā)光（Aggregation-induced emission, AIE）光診療劑（theranostic），它能夠特異性地定位于肝癌細(xì)胞中的脂滴，并在光照射下同時(shí)產(chǎn)生活性氧，以誘導(dǎo)癌細(xì)胞通過鐵死亡和焦亡兩種方式死亡。該文章于2024年10月發(fā)表于《Chemical Engineering Journal 》，IF=13.3。

酞酰亞胺衍生物因其獨(dú)特的光物理特性和生物相容性被廣泛用作潛在的熒光團(tuán)。然而，平面的酞酰亞胺環(huán)增加了π-π堆疊相互作用，從而導(dǎo)致在聚集狀態(tài)下猝滅。研究者設(shè)想通過簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)改變，最小化有害的π-π堆疊相互作用，同時(shí)保持其光學(xué)和電化學(xué)行為。圖1顯示了這種設(shè)計(jì)的示意圖。三苯胺（TPA）基團(tuán)被用作電子給體，而酞酰亞胺單元被用作電子受體。研究者采用了兩種光學(xué)改進(jìn)策略：在D-A模塊之間插入各種π間隔基團(tuán)（A組）和在酞酰亞胺單元的氮原子上附加另一個(gè)π共軛系統(tǒng)（B組）（圖2）。具有較大空間位阻的TPA預(yù)計(jì)將適應(yīng)非平面的螺旋槳形狀構(gòu)象，這可以防止在聚集狀態(tài)下的π-π堆疊相互作用，從而增強(qiáng)發(fā)射。研究者期望在TPA和酞酰亞胺之間添加π間隔基團(tuán)，使AIE的π共軛更長(zhǎng)（LPSP、LPT和LPSP2）（圖2）。還在TPA上附加了一個(gè)對(duì)二甲氧基團(tuán)以增強(qiáng)推拉效應(yīng)（LPM）。引入π間隔基團(tuán)或更強(qiáng)的給體可以增強(qiáng)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）效應(yīng)，并通過改善HOMO-LUMO分離來提高ISC效率，從而降低能帶間隙并增加產(chǎn)生ROS的能力。

圖1. LP化合物的設(shè)計(jì)思路

研究者評(píng)估了合成化合物的光學(xué)性質(zhì)，特別是它們?cè)诓煌軇┲械陌l(fā)射光譜變化，揭示了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）躍遷的存在。通過調(diào)整水/乙腈溶劑系統(tǒng)中的水含量，觀察到LPSP、LPO和LPSP2化合物在高水含量下發(fā)射顯著增加，顯示出聚集誘導(dǎo)發(fā)射（AIE）特性（圖3C-D）。此外，這些化合物在水溶液中形成了適合生物成像的均勻納米顆粒。通過測(cè)量不同狀態(tài)下的熒光壽命，進(jìn)一步證實(shí)了LP化合物的AIE特性，表明這些化合物在聚集和固態(tài)下具有更長(zhǎng)的熒光壽命（圖3G）。

為了探究LP化合物作為光診療劑的潛力，通過H2DCF-DA、ABDA和DHR123作為指示劑共培養(yǎng)，測(cè)量了光誘導(dǎo)的ROS生成，監(jiān)測(cè)了光譜的變化（圖4）。H2DCF-DA指示的ROS總量在LPSP2、LPT和LPSP中的水平明顯高于其他化合物（圖4A），表明與LPO相比，添加π間隔基團(tuán)（雙鍵、噻吩或三鍵）成功增強(qiáng)了ROS的產(chǎn)生。據(jù)光學(xué)數(shù)據(jù)，與LPO相比，A組和B組都有效地展現(xiàn)了紅移發(fā)射。LPSP2、LPT和LPSP中額外的π間隔基團(tuán)（雙鍵、噻吩環(huán)和三鍵）通過H2DCF-DA檢測(cè)到的ROS總量明顯高于其他化合物。利用LP AIEgens觀察到的ROS生成能力，使用MTT評(píng)估了體外光動(dòng)力治療效率。HeLa細(xì)胞被處理與不同濃度的合成光診療劑，然后用藍(lán)色LED（900 lm/m^2）不同時(shí)間照射。在暗條件下，所有LP AIEgens的光毒性可以忽略不計(jì)；然而，在光存在的情況下，每個(gè)LP化合物的光誘導(dǎo)細(xì)胞毒性顯示出不同程度的PDT活性（圖4D）。

隨后，研究者使用共聚焦激光掃描顯微鏡研究了選定的AIE-PSs（LPSP、LPT和LPSP2）在活HeLa細(xì)胞中的亞細(xì)胞器靶向特性。與LipidTOX Deep Red、LysoTracker Deep Red和MitoTracker Deep Red的共定位分析表明LPSP、LPT和LPSP2選擇性地在脂滴中積累（圖5A-5C），但在溶酶體或線粒體中沒有。這些AIEgens在激光照射下的光穩(wěn)定性明顯高于LipidTOX Deep Red（圖5D）。接下來，研究者評(píng)估了LPSP2對(duì)癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的選擇性。HepG2和NIH-3T3細(xì)胞共培養(yǎng)并用10 μM的LPSP2染色。在HepG2細(xì)胞中觀察到明顯的熒光，而在NIH-3T3細(xì)胞中熒光可以忽略不計(jì)（圖5E）。

研究者還使用SOSG、DHE、HPF和BODIPY C11（圖6）測(cè)量了LPSP2在HepG2細(xì)胞中產(chǎn)生的ROS，結(jié)果表明在LED光照射下LPSP2在HepG2細(xì)胞中產(chǎn)生了I型ROS（超氧陰離子和過氧化物）。當(dāng)用405nm激光照射處理LPSP2的HepG2細(xì)胞時(shí)，時(shí)間序列成像分析顯示BODIPY C11從紅色到綠色熒光的逐漸比率轉(zhuǎn)換（圖6A），表明在活細(xì)胞中產(chǎn)生了大量過氧化物。值得注意的是，脂質(zhì)過氧化在光照射下急劇增加，與GSH-GPX4軸功能障礙后幾小時(shí)內(nèi)脂質(zhì)過氧化物水平的緩慢升高形成對(duì)比。隨后，研究者通過測(cè)量了GPX4水平，發(fā)現(xiàn)LPSP2顯著降低了GPX4水平，并依賴于光照和濃度（圖6B-C）。此外，使用鐵死亡抑制劑Fer-1、Lip-1和β-巰基乙醇（圖6D-E）的情況下，GPX4水平以及細(xì)胞活性恢復(fù)。因此，脂質(zhì)ROS的積累與細(xì)胞中GPX4的降低有關(guān)，表明LPSP2誘導(dǎo)的鐵死亡細(xì)胞死亡。

如圖6F所示，BODIPY C11與LPSP2共定位明顯，表明在LPSP2處理和光照射下在脂滴中形成了脂質(zhì)過氧化物。此外，長(zhǎng)時(shí)間照射的細(xì)胞顯示出更多的氧化BODIPY C11的綠色信號(hào)，這些信號(hào)圍繞著脂滴（圖6F）。為了弄清LPSP2在HepG2細(xì)胞中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物的位置，研究者使用MitoTracker Deep Red和ER Tracker Blue-White與BODIPY C11共染，LPSP2在20分鐘照射后產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物并沒有在線粒體中積累，而是主要定位在ER室。通過轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞與表達(dá)ER蛋白的pEF.myc.ER-E2-Crimson（圖6G）也證實(shí)了與ER的共定位。這些結(jié)果表明，脂質(zhì)過氧化物主要是在短時(shí)間照射時(shí)在脂滴中產(chǎn)生和檢測(cè)到的，而隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，它們轉(zhuǎn)移到ER中，引發(fā)HepG2細(xì)胞的ER應(yīng)激。

活細(xì)胞共聚焦成像顯示，與短時(shí)間照射的細(xì)胞相比，LPSP2處理的細(xì)胞在20分鐘照射的細(xì)胞中脂滴數(shù)量顯著增加（圖7A）。大脂滴的百分比以照射時(shí)間依賴的方式減少（圖7B）。阻斷自噬和細(xì)胞質(zhì)脂解的情況下，20分鐘照射樣本中的大脂滴數(shù)量顯著增加（圖7B）。統(tǒng)計(jì)分析顯示，在這些條件下脂滴的大小有顯著差異（p < 0.001）。此外，與未處理樣本相比，用lalista-2處理的樣本中圍繞脂滴的氧化BODIPY C11的信號(hào)顯著降低，表明lalista-2阻斷了脂質(zhì)過氧化物向ER的運(yùn)輸（圖7A）。在用LPSP2和藍(lán)色LED光照射處理后，LC3-II/LC3-I的比例逐漸增加（圖7C），反映了在光條件下脂滴周圍自噬體的形成。此外，在長(zhǎng)時(shí)間照射的細(xì)胞中也表明了Rab7介導(dǎo)的脂滴自噬。研究者用LPSP2的共聚焦活細(xì)胞成像的發(fā)現(xiàn)與wb一致，表明在光動(dòng)力治療下，脂滴通過脂解和脂滴自噬分解，增加了HepG2細(xì)胞中多不飽和脂肪酸（PUFAs）的脂質(zhì)過氧化水平，有助于鐵死亡。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了在脂滴中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物在ER中積累，表明脂滴分解途徑有助于調(diào)節(jié)鐵死亡的敏感性。

研究者發(fā)現(xiàn)用405nm單色光或藍(lán)色LED光長(zhǎng)時(shí)間照射后LP處理的細(xì)胞后，細(xì)胞中出現(xiàn)小泡（圖8A）。為了監(jiān)測(cè)細(xì)胞膜的變化，研究者對(duì)HepG2細(xì)胞膜進(jìn)行染色后進(jìn)行活細(xì)胞觀察。在光照前細(xì)胞膜是完整的，而脂滴與細(xì)胞膜之間的接觸部位在PDT治療后顯示出細(xì)胞膜逐漸破裂，提示脂滴中的氧化脂質(zhì)可能通過接觸釋放到完整的細(xì)胞膜上，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷。同時(shí)，如圖8B所示，HepG2細(xì)胞在照射后激活Caspase-3和焦亡標(biāo)志物GSDM-E。在焦亡抑制劑存在下，細(xì)胞活性顯著恢復(fù)（圖8C）。鐵死亡以及其他類型的調(diào)節(jié)性壞死，包括壞死和焦亡通過激活NLRP3炎癥體促進(jìn)炎癥。如圖8D-E所示，在照射樣本中NLRP3的表達(dá)水平顯著增加，而在鐵死亡抑制劑（圖8D）處理后幾乎檢測(cè)不到。相反，在補(bǔ)充有焦亡抑制劑的細(xì)胞中（圖8E），NLRP3炎癥體的水平保持較高，表明在使用LPSP2的PDT早期發(fā)生了鐵死亡，在NLRP3激活之前，并且在長(zhǎng)時(shí)間炎癥后轉(zhuǎn)移到了另一種細(xì)胞死亡途徑。在PDT期間順序激活鐵死亡和焦亡尚未有報(bào)道。

由于線粒體損傷是NLRP3途徑激活研究最廣泛的刺激因素，研究者使用TMRE染料來檢查線粒體膜電位，排除了去極化線粒體是LPSP2處理的HepG2細(xì)胞中NLRP3激活的原因。相反，脂滴和ER中脂質(zhì)過氧化物的積累不可避免地導(dǎo)致ER中的氧化應(yīng)激，從而激活NLRP3。

為了驗(yàn)證ER應(yīng)激在NLRP3激活中的作用，研究者評(píng)估LPSP2在PDT條件下未折疊蛋白反應(yīng)的激活，ATF6α、IRE1α和GRP78顯著增加。先前的研究表明ER應(yīng)激、NLRP3炎癥體激活和肝細(xì)胞死亡之間的關(guān)聯(lián)。并且ER應(yīng)激可以通過氧化應(yīng)激、鈣穩(wěn)態(tài)和NF-κB激活來激活NLRP3炎癥體。用LPSP2處理的HepG2細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)也隨著照射時(shí)間的增加而顯著增加（圖8F），以及NF-κB的核轉(zhuǎn)位（圖8G）。PPI分析展示了ATF6α、NF-κB和NLRP3之間的相互關(guān)系（圖8H），表明在LPSP2光照射處理的細(xì)胞中ER應(yīng)激、NF-κB和NLRP3炎癥體激活之間復(fù)雜的相互作用。研究揭示了LPSP2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，然后通過ER應(yīng)激和NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)移到焦亡（圖9）。

為評(píng)估LPSP2介導(dǎo)的光動(dòng)力治療的抗腫瘤療效，研究者構(gòu)建了HepG2細(xì)胞異體移植BALB/c裸鼠模型（圖10A）。相比于對(duì)照組和LPSP2單獨(dú)處理組，LPSP2結(jié)合光照治療顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)（圖10B-E）。而各組之間小鼠的體重沒有明顯差別（圖10F），HE染色結(jié)果表明治療沒有引起小鼠器官病變（圖10G），表明LPSP2介導(dǎo)的光動(dòng)力治療沒有明顯不良影響。為進(jìn)一步評(píng)估LPSP2介導(dǎo)的光動(dòng)力治療的生物安全性，研究者對(duì)模型小鼠進(jìn)行血液計(jì)數(shù)和血清生化分析，三個(gè)組別之間并未發(fā)現(xiàn)明顯差異.以上結(jié)果證明，LPSP2與光照射相結(jié)合，有效抑制HepG2腫瘤模型中腫瘤生長(zhǎng)，而不會(huì)誘導(dǎo)全身毒性，提示其癌癥治療的潛力。

研究者通過AIE光診療劑實(shí)現(xiàn)了對(duì)脂質(zhì)過氧化的時(shí)空控制，AIE光診療劑介導(dǎo)的光動(dòng)力治療能夠順序誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡和焦亡顯示出顯著的抗腫瘤效果，且沒有引起明顯的系統(tǒng)毒性。靶向脂滴的AIE光診療劑為癌癥治療策略提供了新的見解。

實(shí)驗(yàn)方法

設(shè)計(jì)和合成AIE光診療劑、qRT-PCR、MTT實(shí)驗(yàn)、共聚焦激光掃描顯微鏡、熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧、時(shí)間序列成像技術(shù)、線粒體膜電位檢測(cè)、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染、腫瘤細(xì)胞異種移植的裸鼠模型、HE染色、血液計(jì)數(shù)和血清生化分析

Le Bich Hang Pham, Khanh Linh Chung, So-Yeol Yoo, Seoyoung Kim, Bumhee Lim, Jae-Young Lee, Jeeyeon Lee, Sequential induction of ferroptosis and pyroptosis in cancer cells by lipid droplet-targeting AIE theranostics, Chemical Engineering Journal, Volume 498, 2024, 155439, https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.155439.