HoxC5和miR-615-3p協同抑制hTERT的表達，從而抑制腫瘤發生
HoxC5和miR-615-3p協同抑制hTERT的表達，從而抑制腫瘤發生
在細胞分化過程中，端粒酶活性的抑制促進復制性衰老，同時作為包括人類在內的長壽性哺乳類生物腫瘤發生的生理障礙物。然而這其中的內部機制依舊不清楚。因此有研究人員對此進行了研究，并以“HoxC5 and miR-615-3p target newly evolved genomic regions to repress hTERT and inhibit tumorigenesis”為題，發表在Nature Communications（IF=12.124）上。作者研究了miR-615-3p是如何抑制hTERT的表達。miR-615-3p位于基因HOXC5的內含子區域。HOXC5屬于高度保守的控制胚胎發生和發育的轉錄因子同源異型細胞框家族。出乎意料地是HOXC5通過阻斷hTERT啟動子和其末端增強子之間的相互作用抑制hTERT的表達。在長壽的靈長類生物中，hTERT的3’UTR區域和其上游的增強子區域是非常保守的。細胞分化過程中，miR-615-3p和hTERT被激活，并構成前饋環路協調hTERT的轉錄和轉錄后抑制。miR-615-3p和hTERT的表達異常可能有助于癌癥發生過程中hTERT的激活。
研究路線：
研究結果：
圖1 假定的miRNAs靶向hTERT 3’UTR區域的鑒定。a. RT-PCR檢測不同細胞系中hTERT mRNA的表達量。人的胚胎干細胞中hTERT mRNA的表達量設為1。b. TRAP鑒定不同細胞系中端粒酶活性。c-e.與瞬時轉染psiCHECK2空載體的細胞相比，瞬時轉染psiCHECK2-5’UTR、psiCHECK2-3’UTR或psiCHECK2-5’+3’UTR載體的細胞中Renilla/Firefly熒光素酶相對熒光強度。f. 在穩定表達psiCHECK2-5’+3’UTR載體的海拉細胞中使用miRNA抑制劑文庫，log2 Renilla/Firefly熒光素酶熒光強度比率的Z值分布圖。Z值>2.7的選作候選基因進行進一步分析。g-i. 分別瞬時轉染8個候選miRNA抑制劑的海拉細胞中Renilla/Firefly熒光素酶相對熒光強度、hTERT mRNA表達量和端粒酶活性。在干細胞和終端分化細胞中差異表達的miRNA標記為紅色。
圖2 在癌癥細胞中miR-615-3p反向調節hTERT的表達。a.不同物種中miR-615-3p和TERT 3’UTR預測的結合位點示意圖。b.在psiCHECK2-5’+3’UTR報告載體中miR-615-3p結合位點引入突變的示意圖。c.在瞬時轉染野生型或突變體psiCHECK2-5’+3’UTR報告載體的Hela和RKO細胞中Renilla/Firefly熒光素酶相對熒光強度。d、e.在瞬時轉染對照發夾結構或miR-615-3p抑制劑的RKOHOP-92和RXF393細胞中，hTERT mRNA表達量和端粒酶活性。f、g.瞬時轉染空載體或miR-615-3p的過表達載體的RPMI-8226、IGR-OV1和HCC-2998細胞中，hTERT mRNA的相對表達量和端粒酶活性。h.在2個獨立的CRISPR/Cas9介導的miR-615-3p敲除的RKO細胞系中內源miR-615-3p的表達量。i-k.在miR-615-3p敲除的RKO細胞系中hTERT mRNA的相對表達量、端粒酶活性和端粒長度。
圖3 HOXC5抑制hTERT的表達。a.miR-615-3p基因定位于HOXC5內含子區域的示意圖。b、c.載有flag標簽的過表達HOXC5 的慢病毒的Hela、PC-3、U251和BT549細胞中hTERT mRNA的相對表達量和端粒酶活性。d. 載有flag標簽的過表達HOXC5 的慢病毒的Hela、PC-3、U251和BT549細胞中端粒酶長度。e.表達對照發夾結構或兩個獨立的干擾HOXC5的發夾結構的Hela細胞中內源hTERT mRNA的表達量。f. 表達對照發夾結構或兩個獨立的干擾HOXC5的發夾結構的Hela細胞中hTERT mRNA的相對表達量。g. 表達對照發夾結構或兩個獨立的干擾HOXC5的發夾結構的Hela細胞中端粒酶長度。
圖4 人胚胎干細胞WA01中hTERT、miR-615-3p、HOXC5、PBX1-4和MEIS1-3的表達量。a. 人胚胎干細胞在單層培養中的神經分化過程。b.RT-PCR檢測胚胎干細胞WA01神經分化過程中，多潛能基因（NANOG和OCT-4）和神經發育基因PAX6的表達量。胚胎干細胞WA01神經分化過程中，hTERT mRNA（c）、miR-615-3p（d）和HOXC5 mRNA（e）的表達量。f. WA01神經分化P0和P3階段，PBX1-4和MEIS1-3的表達量。
圖5 在Hela細胞中，HOXC5招募Pbx4和Meis3，抑制hTERT的表達。a.HOXC5功能區示意圖。b、c. 載有flag標簽的過表達GFP、WT或突變體（M1或M2）HOXC5的Hela細胞中hTERT mRNA相對表達量和端粒酶長度。d. Western blotting顯示了Hela細胞中GFP、WT和突變體（M1或M2）HOXC5的表達量。e.在Hela細胞中，V5標簽的HOXC5導致特異地Flag標簽的Pbx4的免疫共沉淀反應；但對Flag標簽的Pbx1、Pbx2或Pbx3沒有影響。f. 在Hela細胞中，6xHis標簽的HOXC5蛋白與體外翻譯的、35S-蛋氨酸標記的Pbx4蛋白互作；但是對Pbx1、Pbx2或Pbx3沒有反應。g. 在Hela細胞中，Flag標簽的HOXC5導致V5標簽的Meis3的免疫共沉淀反應；但對V5標簽的Meis1或Meis3沒有影響。h. 在Hela細胞中，瞬時轉染共表達PBX4或MEIS3和HOXC5的質粒協同抑制hTERT mRNA的表達。
圖6 HOXC5通過結合到hTERT上游增強子區域抑制hTERT的表達。a.ChIP-Seq顯示HOXC5和PBX4在hTERT TSS上游-20kb區域結合；hTERT TSS區域富集有H3K27ac和H3K4me1，尤其是在端粒酶陽性的胚胎干細胞（WA01）癌癥細胞（PC-3）中，但是在端粒酶陰性的初級纖維細胞（IMR90）中卻沒有。b. 過表達對照GFP或Flag標簽的HOXC5的PC-3細胞中，RNA聚合酶Ⅱ、H3K4me1he H3K27ac的ChIP結果。c.過表達對照GFP或Flag標簽的HOXC5的A375細胞中，RNA聚合酶Ⅱ、H3K4me1he H3K27ac的ChIP結果。d.WA01細胞中神經分化（P4）前后RNA聚合酶Ⅱ、H3K4me1he H3K27ac的ChIP結果。e.在A375細胞中共表達dCas9-KRAB和對照sgRNAs或sgRNAs靶向HOXC5在hTERT增強子上游-20kb結合區域的內源hTERT mRNA的表達量。f.在PC-3細胞中，與內源HOXC5結合位點相關的前10條生物學過程。
圖7 HOXC5抑制hTERT的表達和腫瘤細胞的生長。在PC-3細胞中表達GFP、miR-615-3p、HOXC5或者同時表達miR-615-3p和HOXC5的體外克隆形成實驗中的典型圖像（a）和表達量（b）。腫瘤生長曲線（c）、腫瘤生長代表圖像（d）和腫瘤重量（e）展示了NSG小鼠注射表達GFP、miR-615-3p、HOXC5或者同時表達miR-615-3p和HOXC5的PC-3細胞后腫瘤生長情況。散點圖展示了THYM（胸腺瘤，上圖）和TGCT（睪丸狀干細胞瘤，下圖）癌癥樣本中hTERT和HOXC5之間的斯皮爾曼相關性（f、i），miR-615-3p和hTERT之間的相關性（g、j）以及HOXC5和miR-615-3p之間的相關性（h、k）。
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