隨著技術的進步，放療(RT)已成為肝細胞癌(HCC)有效的非手術治療手段，全面提高了肝癌患者的局部控制率。然而，一些HCC患者在放療后仍會出現放療抵抗、癌癥復發和遠處轉移。我們之前的研究表明，己糖激酶2 (HK2)是一種強效癌基因，在放療抵抗的HCC細胞系中過表達；然而，其在HCC放療抵抗中的作用尚不明確。本研究證實了HK2在HCC組織中的上調與HCC患者的不良預后有關，并證明HK2在HCC細胞系中通過減輕細胞凋亡和促進細胞增殖發揮抗放療作用。HK2下調與電離輻射聯合作用表現出良好的協同致死效應。機制上，HK2通過與AIMP2絡合，增強其自噬溶酶體依賴性降解，從而減輕電離輻射介導的細胞凋亡，從而增加HCC的放療抵抗。藥理學上，酮康唑可作為HK2的抑制劑，協同增強RT的療效。我們的研究結果表明HK2在肝細胞癌的放療抵抗中起重要作用，可能是提高RT療效的潛在治療靶點。本文于2023年8月發表于Cell Death and Disease（IF=9.0）上。
技術路線

結果
1）高HK2表達有助于肝細胞癌的放療抵抗，并預示預后不良
       在本研究中，我們觀察到HK2蛋白水平在固有IR-R (QGY7701) HCC細胞系中隨著時間的推移而升高，而在放療敏感的HCC細胞系MHCC97H和MHCC97L中則保持不變。此外，在獲得的IR-R細胞系中，HK2并沒有隨著時間的推移而上調(圖1A)，這可能是因為在IR-R細胞系構建過程中持續的放療使高表達HK2的細胞群存活。因此，我們假設HK2是HCC中的放療抵抗基因。為了評估HK2在HCC患者中的表達，我們分析了GEO數據庫(GSE14520和GSE36376)。與鄰近正常組織相比，HCC組織中HK2 mRNA水平升高(圖1B)。Kaplan-Meier生存分析證實，較高的HK2 mRNA表達預示著較差的總生存期(OS)。雖然沒有統計學差異，但高HK2表達的患者有更短無復發生存期(RFS)的趨勢(圖1C)。Western blotting顯示，來自患者的HCC樣本顯示出更高的HK2蛋白水平(圖1D)。HK2的免疫組化染色(IHC)顯示，高HK2表達可預測較短的OS(圖1E, 1F)。單因素和多因素分析顯示，HK2高表達是HCC患者預后不良的獨立危險因素(圖1G,1 H)。這些數據驗證了HK2在HCC組織中mRNA和蛋白水平上調，與HCC患者預后不良呈正相關。

2）HK2在HCC細胞中引起顯著的放療抵抗
       為了進一步研究HK2介導的放療抵抗，我們在放療敏感細胞系(MHCC97H和MHCC97L)中構建了穩定的HK2過表達細胞，在放療抵抗細胞系(MHCC97H IR-R、MHCC97L IR-R和QGY7701)中構建了穩定的HK2敲低細胞。對這些編輯細胞系中的CCK8和集落形成進行了評估。經IR處理后，LV-HK2顯著促進了放療敏感細胞系的生長，而shHK2顯著降低了放療抵抗細胞系的生長(圖2A)。為了評估HK2是否調節細胞對IR損傷的反應，在指定時間進行了組蛋白2A(pH2AX-Ser139)磷酸化的免疫熒光(IF)測定，這是DNA損傷修復的有效指標。pH2AX-Ser139核焦點在LV-HK2細胞中比在對照細胞中消散得更快，而shHK2在放療抵抗細胞中則發揮相反的作用(圖2B、2C)。由于IR可導致細胞死亡，我們對不同HK2水平的細胞進行了凋亡的流式細胞術(FCM)。雖然HK2的表達在沒有IR的情況下對細胞凋亡沒有顯著影響，但LV-HK2可以減少IR誘導的細胞凋亡(圖2D)。與平行細胞相比，shHK2與IR聯合可協同促進放療抵抗細胞的細胞凋亡(圖2D)。Western blotting進一步證實，凋亡相關蛋白，包括Cyto c、Cleaved Caspase 3和Cleaved Caspase 9的水平下降，而抗凋亡蛋白Bcl-xL則隨著HK2的過表達而升高(圖2E)。這些結果表明HK2在體外調節HCC放療抵抗中起著不可或缺的作用。

3）HK2在體內是一種抗放療基因
       在體外實驗的基礎上，我們通過建立裸鼠皮下異種移植模型來研究HK2在體內的作用。HK2過表達可以有效增強放療抵抗，而HK2的低表達可以提高放療敏感并抑制腫瘤生長(圖3A)。我們通過IHC檢測Ki67，觀察到IR在平行組中顯著抑制細胞增殖。而在HK2過表達組中，IR對細胞增殖的抑制作用不明顯(圖3B)。在放療抵抗組中，IR對Ki-67的比例影響較小，而在shHK2組中，IR可顯著抑制皮下腫瘤中Ki-67的比例(圖3B)。我們進一步將小鼠來源的H22 HCC細胞植入裸鼠和C57BL/6小鼠皮下異種移植模型。在裸鼠模型中，IR后HK2過表達組的生長速度高于平行對照組(圖3C)。通過檢測增殖細胞核抗原(PCNA)陽性細胞的比例，我們發現LV-HK2在IR后增加了放療抵抗并維持了增殖(圖3D)。皮下接種H22 LV-RFP的C57BL/6小鼠中，腫瘤消退更快，更頻繁(圖3E)。隨后的PCNA免疫組化表明，H22 LV-HK2細胞在IR后比H22 LV-RFP細胞增殖更活躍(圖3F)。我們還研究了CD8+ T細胞和M2巨噬細胞的浸潤情況。我們的數據顯示，與接種H22 LV-RFP細胞的小鼠相比，接種H22 LV-HK2細胞的小鼠CD8+ T細胞浸潤減少，M2巨噬細胞(CD163+)增加(圖3F)，這意味著HK2可能與IR協同作用抑制免疫系統，從而促進HCC的放療抵抗。

4）HK2通過調節溶酶體依賴性自噬抑制AIMP2蛋白
       為了探索HK2介導的放療抵抗的分子機制，進行了免疫沉淀(IP)和銀染色試驗。使用特異性抗原帶的質譜法獲得AIMP2蛋白。這些結果在IR后MHCC97H LV-HK2和MHCC97L LV-HK2細胞中得到證實(圖4A)。Western blotting結果顯示，IR處理后，AIMP2在HK2過表達細胞系中顯著下調，而在HK2敲低細胞系中上調(圖4B)。根據先前的研究，HK2不作為轉錄因子。因此，我們推斷HK2通過轉錄后修飾介導AIMP2下調。為了確認未編輯細胞中HK2和AIMP2之間的關系，我們進行了Co-IP。我們觀察到HK2和AIMP2僅在IR后才在蛋白水平上共定位(圖4C)。同時進行了IF。IR后，細胞質中HK2信號與AIMP2信號重疊，而沒有IR時則不重疊(圖4D)。這些結果證實了HK2和AIMP2在細胞和蛋白水平上的共定位。接著，我們使用自噬抑制劑氯喹(CQ)或蛋白酶體抑制劑MG-132預處理放療敏感的LV-RFP和LV-HK2細胞，然后進行IR預處理。CQ處理成功逆轉了AIMP2的下調，而MG-132處理則沒有(圖4E)。為了進一步研究自噬在AIMP2降解中的作用，WB檢測了經典自噬相關蛋白LC3、P62和Beclin1的表達。與IR聯合使用時，與LV-RFP組相比，LV-HK2上調Beclin1水平，增強LC3 II脂化，下調P62水平；而shHK2的作用則相反(圖4F)。LC3 II的IF也與HK2的表達呈正相關(圖4G, H)。自噬泡的透射電鏡(TEM)圖像顯示，放療抵抗細胞系在IR后比放療敏感細胞系產生更多的自噬泡，進一步證明了HK2與自噬之間的關系(圖4I)。轉染mCherry-GFP標記的LC3 II后，在放療抵抗細胞系中觀察到更多的自噬泡和自噬通量上調(圖4J)。這些結果表明HK2與IR聯合上調自噬，并進一步降低AIMP2蛋白水平。

5）HK2的抗放療效應部分是由AIMP2降解引起的
       我們假設HK2在放療抵抗中的作用部分是由AIMP2功能受損介導的。Western blotting和FCM顯示siAIMP2能夠部分逆轉IR后shHK2引起的細胞凋亡上調(圖5A, 5B)。相應地，LV-AIMP2部分促進IR后由于LV-HK2而減少的細胞凋亡(圖5A,5B)。在體內，在IR后的MHCC97H LV-HK2和LV-RFP細胞中，AIMP2過表達減緩了腫瘤的生長。在LV-HK2組中，與對照組相比，高水平的AIMP2導致HK2過表達引起的腫瘤體積增加的保持(圖5C)。Cyto C和Ki67的免疫組化表明，AIMP2的高表達增強了LV-HK2細胞的凋亡，部分抑制了HK2過表達引起的增殖增加(圖5D)。這些結果表明HK2的放療抵抗功能部分是由于AIMP2在體內的降解。

6）藥理抑制HK2可顯著減輕其抗放療作用
       考慮到HK2在HCC中的主要表達，我們推測HK2抑制可能對HCC具有高度選擇性。酮康唑(Ketoconazole, Keto)是FDA批準的常用抗真菌藥物，通過靶向HK2抑制膠質母細胞瘤細胞增殖。CCK8實驗顯示，Keto治療部分抑制細胞存活，而Keto和IR聯合治療進一步促進了協同致死效應(圖6A)。Western blotting顯示，Keto部分增強了LV-HK2細胞的凋亡水平，與IR結合進一步增加細胞凋亡(圖6B)。隨后建立MHCC97H LV-HK2或H22 LV-HK2裸鼠皮下異種移植模型。在IR治療前一天開始腹腔注射Keto，并以20 mg/Kg的濃度每兩天維持一次(圖6C)。Keto和IR治療均部分減少腫瘤體積并抑制腫瘤細胞增殖，而聯合治療可協同抑制腫瘤體積和生長速率(圖6D, 6E)。免疫組化實驗顯示，與單獨使用Keto或IR相比，Keto聯合IR顯著抑制了增殖和自噬，并提高了凋亡(圖6G)。Keto治療對小鼠體重和肝腎指標沒有影響(圖61、6J)。同樣，聯合治療對H22 LV-HK2皮下移植C57BL/6小鼠腫瘤生長的抑制作用較其他治療組明顯(圖6F)。免疫組化實驗也顯示了同樣的結果(圖6H)。同樣，小鼠的體重和活力也沒有受到影響(圖6K、6L)。此外，聯合治療組腫瘤中CD8+ T浸潤增加，M2巨噬細胞減少，表明聯合治療對免疫缺陷的逆轉效果更好(圖6M-6P)。這些體外和體內實驗結果表明，HK2的藥理靶向可能是HCC中IR的有效輔助手段，具有很大的臨床轉化潛力。

結論
       這項研究揭示了HK2在HCC放療抵抗中的作用。HK2可能成為HCC放療的潛在治療靶點。

實驗方法
CCK8，克隆形成實驗，WB，IHC，qRT-PCR，流式，免疫共沉淀，銀染，免疫熒光。
參考文獻
Zheng Y, Zhan Y, Zhang Y, Zhang Y, Liu Y, Xie Y, Sun Y, Qian J, Ding Y, Ding Y, Fang Y. Hexokinase 2 confers radio-resistance in hepatocellular carcinoma by promoting autophagy-dependent degradation of AIMP2. Cell Death Dis. 2023 Aug 1;14(8):488. doi: 10.1038/s41419-023-06009-2.