前列腺癌（PC）的骨轉移頻率最高，且對¹⁷⁷Lu-前列腺特異性膜抗原（PSMA）放射性配體療法的耐藥性很強。目前人們對骨轉移性前列腺癌（mPCa）對放射治療的耐藥性知之甚少。該研究發(fā)現(xiàn)骨特異性m6A修飾的增強子RNA（eRNA）在調控mPCa進展和放療抵抗中發(fā)揮重要作用。本文于2023年1月發(fā)表在《Theranostics》IF：12.4期刊。

技術路線

主要實驗結果
1、在骨mPCa中鑒定特異性eRNA修飾
       作者比較了有無化療的患者之間的存活情況以探究化療抵抗和骨mPCa患者之間的關系。結果發(fā)現(xiàn)PSMA放療延長原發(fā)PCa患者和淋巴結（LN）mPCa的存活時間，但是對骨mPCa的作用有限（附圖1A）。鑒于增強子和eRNA是組織特異性和功能特異性的元件，作者探索了骨mPCa中的特異性eRNA，并表征了表觀轉錄組的骨mPCa相關功能。在CRPC細胞中通過RNA-seq鑒定的100個差異上調的增強子轉錄本中，發(fā)現(xiàn)43個eRNA在骨mPCa PC3細胞中高表達（圖1A）。作者此前檢測m6A是否是致癌骨mPCa中eRNA的特異性修飾，發(fā)現(xiàn)通過兩種不同的m6A抗體結合MeRIP-seq免疫沉淀，發(fā)現(xiàn)6個帶有m6A信號的eRNA。隨后，通過基因間峰選擇和qPCR驗證篩選6個eRNA，結果在骨mPCa細胞中有一個獨特的m6A eRNA上調（圖1A-B）。對LNCaP和PC3細胞已發(fā)表的ChIP-seq數(shù)據(jù)的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域是一個真正的增強子，表現(xiàn)為可富集增強子激活子（BRD4）、增強子標記物（H3K4me1和H3K27ac）和啟動子標記物（H3K4me3）（圖1B）。根據(jù)eRNA的命名規(guī)則，作者將該eRNA標記為MLXIPe，因為它與MLXIP mRNA接近。兩個推測的m6A位點(#1:TTACA chr12 122502280-122502284;#2: GGACA chr12 122506423-122506427)在MLXIPe中被兩個獨立的m6A抗體鑒定（圖1B）。

附圖1 MLXIPe的m6A是患者的不良預后因素

       從原發(fā)性前列腺癌、鄰近正常前列腺組織和骨轉移癌的新鮮樣本中收集了m6A抗體免疫沉淀的RNA，以證明m6A修飾在臨床病理背景下的功能作用。箱形圖顯示，在該隊列中，骨mPCa樣本中MLXIPe的#2-m6A水平明顯高于原發(fā)性PCa或鄰近前列腺樣本（圖1C-D）。然而，在mPCa、原發(fā)性PCa和鄰近前列腺正常組織樣本之間，MLXIPe的#1-m6A水平無顯著差異（附圖1B）。此外，發(fā)現(xiàn)MLXIPe的#2-m6A水平在骨mPCa細胞系PC3和C4-2B中顯著升高（附圖1C-D），但MLXIPe的#1-m6A水平在所有細胞系中沒有差異（附圖1E）。在骨轉移隊列中，進一步確定MLXIPe #2-m6A水平與PCa患者臨床特征的生存意義。Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，在骨mPCa患者中，MLXIPe的RNA和m6A水平升高與較短的生存期相關（圖1E-F）。PET分析顯示，在前列腺癌患者73 (P-73) ^{mlxipe - m6low}中，遠端骨轉移腫瘤信號在放療后消失，但在P-90^{MLXIPe-m6Ahigh}中，脊柱兩側和骨盆均檢測到較強的信號（圖1G），提示MLXIPe-m6A^high患者存在放療耐藥。總而言之，MLXIPe的m6A修飾是骨mPCa所特異性的。

圖1 MLXIPe的m6A參與PC的轉移和化療

2、MLXIPe誘導的mPCa放療抵抗是通過上調PSMD9
       eRNA通過增加增強子-啟動子環(huán)將增強子活性轉移到一個或幾個相鄰的目標啟動子上。為確定受MLXIPe增強子調控的下游啟動子，使用類似于染色體構象捕獲(3C)的策略研究了相鄰啟動子，并使用捕獲Hi-C（cHi-C）技術分析了已發(fā)表的數(shù)據(jù)。通過cHi-C的增強子-啟動子環(huán)確定了MLXIPe周圍的11個mRNA（圖2A）。通過RNA-seq數(shù)據(jù)排除PCa細胞中無表達的4個mRNA，通過3C檢測確定了人骨- mPCa患者來源的異種移植(PDX)原代細胞系90 (P-90)中7個啟動子的空間組織。3C數(shù)據(jù)顯示，利用反義寡脫氧核苷酸(ASOs)敲除MLXIPe會降低MLXIPe與WDR66、PSMD9、SETD1B和MLXIP位點之間的特異性增強子-啟動子相互作用（圖2A）。在通過基因組DNA相互作用鑒定出MLXIPe靶基因后，研究MLXIPe是否影響它們的轉錄。用ASOs敲除MLXIPe，驗證eRNA對靶蛋白表達的作用。利用3個獨立的ASOs進行逆轉錄qPCR和RNA-seq數(shù)據(jù)顯示，MLXIPe下調骨- mPCa原代細胞系P-90和PC3細胞中這4個靶基因的表達（圖2B-C）。還發(fā)現(xiàn)PSMD9是一個特異性的骨- mPCa相關基因，但WDR66、SETD1B和MLXIP是致癌基因（圖2D）。較高水平的PSMD9與較低的放療后無復發(fā)生存率相關（圖2E）。綜上所述，PSMD9作為MLXIPe骨特異性靶基因，與骨mPCa患者的放療耐藥和較短的生存期相關。

圖2 PSDM9是受到MLXIPe調控的靶基因并參與化療抵抗

3、MLXIPe通過m6A與KHSRP相互作用
       通過生成 CRISPR 對照（Ctrl）和 MLXIPe #2-m6A 位點缺失（-del）細胞系，用生物素標記的探針靶向 MLXIPe eRNA 或 PSMD9 mRNA 進行無偏串聯(lián)親和純化，從而探索了m6A在MLXIPe的分子機制。質譜分析結果表明MLXIPe eRNA與多種蛋白質結合，包括對照（Ctrl）細胞中的循環(huán)蛋白 MED12和KH結構域蛋白hnRNPK、IGF2BP2或KHSRP，但在MLXIPe -m6A-del細胞中與KH結構域蛋白沒有結合（圖3A）。類似地，PSMD9 mRNA在Ctrl細胞中與幾種蛋白結合，包括翻譯蛋白eIF4A1、eIF4G2和KH結構域蛋白KHSRP，但在eRNA-m6A-del 細胞中不與KH結構域蛋白結合（圖3A）。KHSRP是一種與多種癌癥有關的RNA結合蛋白，是兩組引物中的共同蛋白（圖3B）。我們敲除了KHSRP蛋白的四個結構域（N-端、KH1/2、KH3/4或C-端缺失），以證實質譜數(shù)據(jù)（圖 3C）。交聯(lián)免疫沉淀（CLIP）-PCR檢測表明，KH1/2缺失結構域阻斷了KHSRP蛋白與PSMD9 mRNA的相互作用（圖3D），KH3/4缺失結構域顯著抑制了KHSRP與MLXIPe的相互作用（圖3E）。此后，作者進一步證明KHSRP是m6A和m6Am的雙解讀器，通過KH1/2結構域與m6Am相互作用，通過KH3/4結構域與m6A相互作用（圖4A）。

圖3 KHSRP與eRNA和mRNA結合形成一個復合物

4、KHSRP通過與eRNA連接來穩(wěn)定mRNA
       鑒于m6A可調控mRNA的穩(wěn)定性，所以作者檢測了P-90細胞中RNA的半衰期，以確認m6Am與mRNA穩(wěn)定性的相關性。數(shù)據(jù)表明，2號m6A 缺失增加了PSMD9 mRNA降解，但在P-90和PC3胞中，1號-m6Am位點缺失未能完成降解（圖4B）。用兩個獨立的shRNA去掉KHSRP能顯著下調PSMD9 RNA水平并增強PSMD9 mRNA降解（圖4C-D）。據(jù)報道，m6Am的writer是PCIF1。PCIF1-KD損害了MLXIPe升高的PSMD9 RNA水平（圖4E）。XRN1和XRN2是高度過程性的5' > 3'外切核酸酶。基因敲除試驗表明，XRN2而不是XRN1是負責PSMD9 mRNA 降解的5' > 3' 外切核酸酶（圖4F）。敲除KHSRP會增加PSMD9 mRNA與XRN2的結合（圖4G）。此外，敲除XRN2會提高PSMD9 mRNA的穩(wěn)定性（圖4H）。這些數(shù)據(jù)表明，MLXIPe-KHSRP-PSMD9阻斷了骨 mPCa細胞中XRN2誘導的PSMD9 mRNA降解（圖4I）。

圖4 eRNA-KHSPR-mRNA復合物保護PSMD9 mRNA抵抗XRN2

5、MLXIPe通過m6A提高PCa細胞中DNA修復蛋白的水平
       文獻表明PSMD9是與乳腺癌細胞放療抗性相關的放療預測標記物。本研究發(fā)現(xiàn)，MLXIPe通過eRNA m6A介導PSMD9 mRNA的穩(wěn)定性并上調其蛋白水平（圖4）。作者從PDX隊列中選擇了4個MLXIPe m6A^high和MLXIP m6A^low的原發(fā)性骨-mPCa PDX細胞，以確定MLXIPe m6A是否是骨-mPCa中特異的放療耐藥性標志物。不同劑量輻射曲線數(shù)據(jù)表明，MLXIPe m6A^high的細胞對放療具有抗性；然而，MLXIPe m6A^low的細胞則以劑量依賴的方式被輻射殺死（圖5A）。WB顯示，在MLXIPe m6A^high細胞中，ATM、DNA-PKcs和p53蛋白水平上調，但ATR的表達不受影響（圖5B）。
       作者敲除MLXIPe中的m6A，以進一步證實m6A在DNA修復途徑中的功能。表達數(shù)據(jù)顯示，MLXIPe WT而非MLXIPe-m6A缺失會提高ATM、DNA-PKcs和p53蛋白水平（圖5C）。在MLXIPe m6A^low的P-73細胞和MLXIPe m6A^high的P-90細胞中驗證了eRNA-KHSRP-mRNA復合物在DNA修復途徑中的功能。數(shù)據(jù)顯示，KHSRP的缺失抑制了MLXIPe對ATM、DNA-PKcs和p53蛋白的上調，并降低了MLXIPe m6A^low P-73細胞中γ-H2AX病灶的比例（圖5D）。同時，在MLXIPe m6A缺失的細胞中，XRN2敲除可挽救ATM、DNA-PKcs和p53蛋白水平，并提高γ-H2AX病灶的比率（圖5E）。這些數(shù)據(jù)表明，MLXIPe通過m6A和KHSRP復合物提高骨-mPCa細胞中的ATM、DNA-PKcs和p53蛋白水平。

圖5 MLXIPe上調DNA修復通路的關鍵蛋白

6、MLXIPe通過m6A和KHSRP增強前列腺PDX放療耐藥性
       通過編輯4個MLXIPe m6A^high PDX細胞中的m6A位點，測試MLXIPe的m6A在PDX細胞中的功能。數(shù)據(jù)顯示，在MLXIPe m6A位點缺失（-del）的mPCa細胞中，放療抗性受損，放射敏感性恢復（圖6A-B）。接下來，在體內異種移植模型中測定了MLXIPe的m6A功能，并考察了MLXIPe的m6A調控對前列腺異種移植生長和放射抗性的影響。將MLXIPe-m6A-del細胞注射到小鼠側腹，數(shù)據(jù)顯示MLXIPe-m6A敲除后，異種移植物的生長略有下降，而KHSRP-KD轉染則不影響異種移植物的生長（圖6C-D）。值得注意的是，MLXIPe-m6A-del組和KHSRP-KD組在放療36天后恢復放射敏感性，而Ctrl組沒有恢復（圖6D）。qPCR數(shù)據(jù)顯示，PSMD9 mRNA與異種移植物的放療抗性相關（圖6E-G）。因此，數(shù)據(jù)表明，MLXIPe或KHSRP的m6A可提高PDX模型中mPCa的放療耐受性。

圖6 在體內MLXIPe誘導化療抵抗

       總之，本研究提供了有關mPCa RT抗性、eRNA修飾和潛在m6Am閱讀器機制的新見解。檢測到骨特異性eRNA與m6A，后者促進骨轉移前列腺PDXs的 放療抗性功能。KHSRP能識別eRNA上的m6A和mRNA 5'-UTR上的m6Am并與之相互作用，從而阻斷XRN2對5'-UTR上RNA的降解。研究結果表明，骨特異性eRNA-m6 在 mPCa生長和放療抗性方面至關重要，可能成為癌癥治療的新靶點（圖6）。我們的研究強調了MLXIPe是骨-mPCa的潛在預測性生物標記物和治療靶點。

圖像摘要

實驗方法
臨床樣本收集，患者來源的異種移植（PDX），正電子發(fā)射斷層掃描（PET），小鼠異種移植瘤模型，生物素標記的RNA pull down，WB，CRISPR)-Cas9，交聯(lián)免疫沉淀（CLIP），γ-H2AX染色
參考文獻
Zhao Y, Wen S, Li H, Pan CW, Wei Y, Huang T, Li Z, Yang Y, Fan S, Zhang Y. Enhancer RNA promotes resistance to radiotherapy in bone-metastatic prostate cancer by m6A modification. Theranostics. 2023 Jan 1;13(2):596-610. doi: 10.7150/thno.78687. PMID: 36632223; PMCID: PMC9830431.