結(jié)直腸癌多標(biāo)記轉(zhuǎn)錄分類反映腫瘤細(xì)胞群體的異質(zhì)性
背景：轉(zhuǎn)錄分類已被用于將結(jié)直腸癌（CRC）分成具有不同生物學(xué)和臨床特征的分子亞型。然而，目前尚不清楚這些亞型是否代表著離散的、互斥的實(shí)體，還是具有潛在重疊的分子/表型狀態(tài)。因此，我們將重點(diǎn)放在CRC固有亞型(CRIS)分類器上，并評估將多個(gè)CRIS亞型分配給同一樣本是否提供額外的臨床和生物學(xué)相關(guān)信息。
方法：我們使用CRIS分類器的多標(biāo)簽版本（multiCRIS）對新生成的606個(gè)CRC患者來源的異種移植物（PDXS）的RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，同時(shí)結(jié)合了人類CRC批量和單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)集。比較了單標(biāo)簽和多標(biāo)簽CRIS的生物學(xué)和臨床相關(guān)性。最后，開發(fā)了基于機(jī)器學(xué)習(xí)的多標(biāo)簽CRIS預(yù)測器（ML2CRIS）用于單個(gè)樣本的分類。
結(jié)果：令人驚訝的是，約一半的CRC病例可以明顯地分配給多個(gè)CRIS亞型。單細(xì)胞RNA測序分析揭示，多個(gè)CRIS成員身份可能是由于同時(shí)存在不同CRIS類別的細(xì)胞，或者較少情況下由于具有混合表型的細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)多標(biāo)簽分配可以改善對CRC預(yù)后和治療反應(yīng)的預(yù)測。最后，ML2CRIS分類器在單個(gè)樣本分類的情境下被驗(yàn)證具有相同的生物學(xué)和臨床相關(guān)性。
結(jié)論：這些結(jié)果表明，即使同時(shí)分配給同一CRC樣本，CRIS亞型仍保留其生物學(xué)和臨床特征。這種方法有潛力在其他癌癥類型和分類系統(tǒng)中推廣應(yīng)用。
該研究于2023年5月發(fā)表發(fā)表在《Genome medicine》，IF：15.266。
技術(shù)路線：
實(shí)驗(yàn)方法：異種移植物收集、TCGA和PDX RNA-SEQ數(shù)據(jù)預(yù)處理、CRC單細(xì)胞數(shù)據(jù)及其預(yù)處理、bulk/scRNA-seq數(shù)據(jù)和預(yù)處理、scRNA-seq數(shù)據(jù)的偽批量、CRIS分類、單標(biāo)簽分級機(jī)、多標(biāo)號單樣分級機(jī)。
1、結(jié)直腸癌內(nèi)在亞型的多標(biāo)簽CRIS分層研究
為了改善結(jié)直腸癌的分層，并根據(jù)CRIS分類捕捉生物特征，我們推斷其最近模板預(yù)測（NTP）算法不僅可以用于指定最顯著的單一類別，還可以評估每個(gè)樣本對所有CRIS類別的分配，以及每個(gè)分配的虛假發(fā)現(xiàn)率。因此，我們實(shí)施了基于NTP的CRIS分類器的新的多標(biāo)簽版本，名為“multiCRIS”，能夠根據(jù)與每個(gè)CRIS中心點(diǎn)的距離和其顯著性將每個(gè)樣本分配給一個(gè)或多個(gè)CRIS類別。
首先，將MultiCRIS應(yīng)用于來自癌癥基因組圖譜（TCGA）的620個(gè)樣本的RNA測序數(shù)據(jù)集，以明確地將91%的樣本至少分配給一個(gè)類別（圖1a）。有趣的是，52%的樣本還可以被確信地分配給其他CRIS亞型（圖1b）。
值得注意的是，對于所有的CRIS亞型，次要分配的數(shù)量與主要分配大致相等（圖1c）。多重分配主要發(fā)生在兩個(gè)特定的亞家族之間：CRISA/CRIS-B和CRIS-C/CRIS-D/CRIS-E。最后，為了評估這些多重分配是否捕捉到具有多個(gè)CRIS生物特征的腫瘤，我們探索了與每個(gè)CRIS類別相關(guān)的主要特征。
有趣的是，分配給次要類別的樣本在圖1d中顯示了類別的關(guān)鍵分子特征，包括CRIS-A中的MSI狀態(tài)，CRIS-C中的KRAS突變的消失，以及CRIS-D/CRIS-E中的WNT信號通路活性和CRIS-B樣本中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。值得注意的是，我們觀察到具有多個(gè)分配的樣本傾向于與CRIS中心點(diǎn)之間的距離較大，這可能反映了同時(shí)具有不同表型的細(xì)胞組成或具有不同表型的細(xì)胞混合的情況。
圖1展示了針對TCGA數(shù)據(jù)集中的596個(gè)結(jié)直腸癌樣本進(jìn)行的多標(biāo)簽CRIS分類的結(jié)果。
2、多個(gè)CRIS分配中的單細(xì)胞異質(zhì)性。
觀察到一部分結(jié)直腸癌的多個(gè)類別分配可以通過兩種方式解釋：腫瘤由具有模糊表型的癌細(xì)胞組成，或者存在混合的不同亞型細(xì)胞群體。為了探索支持多個(gè)CRIS分配的異質(zhì)性，我們在一個(gè)由PDXS（患者源性異種移植）衍生的5個(gè)結(jié)直腸癌器官樣本集合中進(jìn)行了一系列的配對單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）和批量譜分析。這些數(shù)據(jù)允許直接比較單細(xì)胞和批量轉(zhuǎn)錄組譜分析結(jié)果。作為第三個(gè)選擇，通過聚合一個(gè)樣本中所有單細(xì)胞譜分析結(jié)果來獲得偽批量譜分析結(jié)果。值得注意的是，盡管來自單個(gè)細(xì)胞的譜分析結(jié)果平均捕獲了至少5個(gè)支持讀數(shù)的1116個(gè)轉(zhuǎn)錄本，但偽批量譜分析結(jié)果平均涵蓋了超過17,095個(gè)轉(zhuǎn)錄本。如預(yù)期的那樣，匹配的批量/偽批量樣本的譜分析結(jié)果顯示了強(qiáng)烈的相關(guān)性，而無法通過非匹配比較獲得。這些結(jié)果表明，（i）單細(xì)胞譜分析結(jié)果顯示出高度的異質(zhì)性，以及（ii）聚合的單細(xì)胞譜分析結(jié)果能夠重現(xiàn)批量譜分析結(jié)果中所獲得的轉(zhuǎn)錄組譜。因此，這種3D體外器官樣本培養(yǎng)系統(tǒng)捕獲了具有復(fù)雜轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性的細(xì)胞譜。
值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)存在同時(shí)存在的細(xì)胞混合物，每個(gè)混合物具有一個(gè)單一的CRIS分配，以及具有混合多個(gè)CRIS亞型的細(xì)胞。來自給定器官樣本的個(gè)別細(xì)胞主要被分配到該器官樣本的批量譜分析結(jié)果所定義的CRIS亞型/亞型組（圖2）。
這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了在單細(xì)胞分辨率下，大多數(shù)細(xì)胞被分配到單個(gè)CRIS亞型，并且它們的混合導(dǎo)致了批量轉(zhuǎn)錄組的多亞型分配；然而，也有可能存在一小部分具有混合表型的細(xì)胞，在給定的批量樣本中對多個(gè)CRIS亞型的分配產(chǎn)生貢獻(xiàn)。事實(shí)上，在所有接受多個(gè)CRIS批量分配的器官樣本中，我們檢測到了具有不同CRIS標(biāo)識的細(xì)胞和具有混合表型的細(xì)胞的共存（圖2）。
為了將我們的觀察擴(kuò)展到人類腫瘤，我們利用來自一組患者的公共單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)（GSE132465），重點(diǎn)關(guān)注上皮細(xì)胞，比較偽批量和單細(xì)胞的多標(biāo)簽CRIS分配情況：這種分析證實(shí)了存在多個(gè)CRIS分配的患者。在這些樣本中，我們證實(shí)大多數(shù)單個(gè)細(xì)胞被分配到特定的CRIS亞型（64%的分類細(xì)胞，其中75%被分配到單個(gè)CRIS亞型，25%被分配到多個(gè)CRIS組；圖3a）。然而，類似于器官樣本，每個(gè)樣本由不同的細(xì)胞群體組成，這些細(xì)胞群體被分到不同的CRIS亞型中，導(dǎo)致了一個(gè)復(fù)雜的表型，該表型通過偽批量分析的多個(gè)CRIS分配被捕捉到（圖3b）。因此，被分配到單個(gè)CRIS亞型的樣本往往具有更高比例的被分配到該亞型的細(xì)胞。在特定樣本中，具有多標(biāo)簽分配的單個(gè)細(xì)胞的高百分比可能反映出組織中正在經(jīng)歷功能轉(zhuǎn)變或穩(wěn)定的中間分化階段。例如，在患者SMC17中發(fā)生了這種情況（圖3b），其中57%的分類細(xì)胞顯示出多標(biāo)簽表型。類似地，SMCO3和SMC21患者分別顯示出34%和28%的具有混合表型的細(xì)胞（圖3b），與它們在批量分析中追蹤到的多標(biāo)簽狀態(tài)一致。
總的來說，這些結(jié)果表明，CRIS轉(zhuǎn)錄組的異質(zhì)性根源于單個(gè)細(xì)胞水平，而單個(gè)細(xì)胞的表型總結(jié)起來定義了腫瘤批量的CRIS分類。因此，多CRIS腫瘤的證據(jù)主要可以通過具有特定功能特征的不同細(xì)胞群體的鑲嵌組成或具有混合表型的少量混合細(xì)胞來解釋。
圖2展示了人類器官樣品的MultiCRIS分類結(jié)果。
圖3展示了人類結(jié)腸直腸癌（CRC）的MultiCRIS分類結(jié)果。
3、針對CRIS分類的單樣本方法
MultiCRIS為復(fù)雜的生物學(xué)和臨床結(jié)果鋪平了道路。然而，它受到其NTP實(shí)現(xiàn)的影響，該實(shí)現(xiàn)依賴于在樣本批次上計(jì)算的質(zhì)心距離和基因級別的Z分?jǐn)?shù)，不允許單個(gè)樣本的分類。為了克服這個(gè)問題，我們轉(zhuǎn)向單樣本算法，能夠獨(dú)立地對每個(gè)樣本進(jìn)行分類：這些算法既可以處理只對主要類別進(jìn)行單標(biāo)簽分配的情況（SC），也可以處理多標(biāo)簽分配的情況（MC），以捕捉內(nèi)部的異質(zhì)性。我們的工作流程如圖4所示；它包括對所有算法進(jìn)行初始訓(xùn)練階段（藍(lán)色），在測試數(shù)據(jù)上對它們的性能進(jìn)行評估（粉色），以及對最有希望的單樣本方法進(jìn)行最終的臨床和生物驗(yàn)證（綠色）。我們首先實(shí)現(xiàn)了單樣本單標(biāo)簽算法，能夠識別每個(gè)樣本的最顯著（主要）類別。考慮的方法包括隨機(jī)森林（RF）、線性支持向量機(jī)（LSVM）、多項(xiàng)式（PSVM）和高斯徑向基函數(shù)（GRBF-SVM）核的支持向量機(jī)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（NN）和極端梯度提升樹（XGBoost）。隨后，通過提取每個(gè)樣本的所有CRIS類成員關(guān)系，TESE單樣本算法被適應(yīng)于多標(biāo)簽上下文；這使得能夠?qū)φ斩鄻?biāo)簽NTP(多CRIS)的結(jié)果來驗(yàn)證其結(jié)果。
為了評估每個(gè)算法并確定最適合在臨床應(yīng)用的單樣本分類器中預(yù)測CRIS類別成員資格的算法，我們利用了來自TCGA項(xiàng)目的原發(fā)性結(jié)直腸癌樣本集（n=562）和來自患者衍生的異種移植瘤（PDXS，n=550）的隊(duì)列。TCGA數(shù)據(jù)被分成訓(xùn)練集和測試集，保持整個(gè)數(shù)據(jù)集中CRIS類別比例不變。每個(gè)分類器僅考慮CRIS基因的表達(dá)值作為特征空間，并使用NTP主類作為目標(biāo)參考進(jìn)行訓(xùn)練，無論其是單標(biāo)簽還是多標(biāo)簽的使用。TCGA樣本的30%和完整的PDXS數(shù)據(jù)集被用作兩個(gè)獨(dú)立的測試集，以評估單標(biāo)簽和多標(biāo)簽分類器的結(jié)果。
在針對主要類別分配的單標(biāo)簽評估中，我們使用全局準(zhǔn)確率、精確度和召回率，衍生的度量指標(biāo)（F1分?jǐn)?shù)和馬修斯相關(guān)系數(shù)（MCC）），以及基于閾值的度量指標(biāo)（接收器操作特性曲線下面積和精確率-召回率曲線下面積），以評估所考慮算法的性能，并將其與原始的NTP方法的性能進(jìn)行比較。LSVM在TCGA測試集上達(dá)到了約80%的準(zhǔn)確率，在PDXS上達(dá)到了75%的準(zhǔn)確率，在考慮了所有類別的精確度和召回率時(shí)表現(xiàn)良好（圖5）。雖然XGBoost和RF取得了有趣的表現(xiàn)，但它們的類別特定行為似乎不太穩(wěn)定，并且整體上略遜于LSVM（圖5）。
此外，在單標(biāo)簽情況下，機(jī)器學(xué)習(xí)方法與TSP方法進(jìn)行了比較，TSP方法是單樣本CRIS分類器的首次嘗試，最初顯示出與NTP分類的相當(dāng)有限的一致性。本研究中證實(shí)了其次優(yōu)結(jié)果：我們所有的分類器都比TSP獲得了更高的準(zhǔn)確性，最高準(zhǔn)確率為70.7%。特別是對于LSVM來說，即使在TCGA測試集上F1分?jǐn)?shù)最低的類別（CRIS-E，為73%）也顯著超過了TSP的結(jié)果（CRIS-E為28%）。
在PDXS數(shù)據(jù)集上，LSVM取得了最令人信服的結(jié)果。在TCGA中，CRIS-A是最常見的類別，略多于CRIS-C；其次是CRIS-E，而CRIS-B和CRIS-D的規(guī)模較小但可比較。在PDXS中幾乎可以觀察到相同的趨勢，例外就是CRIS-A類在PDXS中的表示較少，這是因?yàn)閬碜赞D(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的樣本中MSI病例（CRIS-A富集）的稀缺性。
因此，基于性能評估，我們確定LSVM作為最佳的單標(biāo)簽分類器，用于預(yù)測每個(gè)單個(gè)CRC樣本的主要CRIS類別。然而，所有三種訓(xùn)練過的算法都能通過算法自適應(yīng)技術(shù)計(jì)算出對所有5個(gè)CRIS類別的隸屬度，為多標(biāo)簽情景奠定了基礎(chǔ)。
圖4展示了基于機(jī)器學(xué)習(xí)構(gòu)建單樣本CRIS分類器的工作流程。
圖5展示了基于機(jī)器學(xué)習(xí)的CRIS分類器的性能評估結(jié)果
4、通過單樣本方法，進(jìn)行多標(biāo)簽CRIS分類。
在算法自適應(yīng)策略的基礎(chǔ)上，我們開發(fā)了多標(biāo)簽適應(yīng)（mla）的單樣本CRIS分類器。具體來說，每個(gè)mla算法從其單標(biāo)簽版本繼承了主要類別的分配能力，但可以將任何異質(zhì)樣本與一個(gè)或多個(gè)額外的次要類別關(guān)聯(lián)起來。
為了評估m(xù)la分類器，我們使用了與單標(biāo)簽類似但適應(yīng)于多標(biāo)簽環(huán)境的度量指標(biāo)（放寬準(zhǔn)確率、精確率、召回率），以及特定的多標(biāo)簽度量指標(biāo)（平均精確率、Hamming損失、子集準(zhǔn)確率和多標(biāo)簽準(zhǔn)確率）。所有這些指標(biāo)都將mla算法的結(jié)果與本研究中引入的MultiCRIS方法獲得的目標(biāo)分配進(jìn)行比較。
在mla算法中，LSVM在考慮類別精確率和召回率時(shí)仍然達(dá)到了最佳整體性能，顯示出在多標(biāo)簽環(huán)境中也是最穩(wěn)健的方法（圖5）。此外，LSVM在91.7%的情況下分配了主要的多標(biāo)簽CRIS類別（即根據(jù)NTP算法確定的最突出的類別），并且在預(yù)測TCGA測試樣本的多標(biāo)簽特征時(shí)達(dá)到了92.6%的平均精確度。在考慮Hamming損失時(shí)，即錯(cuò)誤分類標(biāo)簽的平均比例，LSVM在TCGA測試集和PDXS集中都具有最低的損失比例。最后，LSVM的子集準(zhǔn)確率（嚴(yán)格相同的標(biāo)簽歸屬）也非常重要，尤其考慮到每個(gè)算法只通過提供主要類別作為參考目標(biāo)進(jìn)行訓(xùn)練。
因此，LSVM顯然是在單標(biāo)簽或多標(biāo)簽視角下執(zhí)行單樣本分類的最佳方法。
5、單標(biāo)簽和多標(biāo)簽LSVM分類器的臨床和生物學(xué)評估
我們首先評估了基于LSVM模型在TCGA數(shù)據(jù)集上的預(yù)后價(jià)值，考慮了不同的情景：僅考慮作為主要類別分配的樣本、僅考慮作為次要類別分配的樣本，或者考慮所有被分類為CRIS類別的腫瘤，不論其是主要還是次要分配。在所有這些情況下，使用Fisher檢驗(yàn)進(jìn)行的任何比較都是針對那些完全未被分配到所研究的CRIS類別的樣本。對于基于NTP和LSVM的單標(biāo)簽分類器，Kaplan-Meier（KM）生存分析證實(shí)了CRIS-B類與不良預(yù)后的顯著關(guān)聯(lián)（圖6a、b）。有趣的是，通過多標(biāo)簽分配，將次要CRIS-B分配的樣本從非CRIS-B組中排除，突出了與不良預(yù)后的更高的相關(guān)性（圖6c、d）。因此，當(dāng)排除具有主要CRIS-B分配的樣本進(jìn)行分析時(shí)，次要CRIS-B分配的樣本顯示出更差的預(yù)后（圖6e、f）。當(dāng)將主要和次要CRIS-B病例合并時(shí)，預(yù)后顯著性達(dá)到最大值（圖6g、h）。值得注意的是，在所有情況下，基于LSVM的分類器具有更高的預(yù)后顯著性。
在PDXS隊(duì)列中評估了對抗EGFR治療的反應(yīng)。我們確認(rèn)了CRIS-C與Cetuximab的敏感性相關(guān)聯(lián)，其中單標(biāo)簽LSVM（優(yōu)勢比（O.R.）= 3.281，置信區(qū)間（CI）= 1.66-6.73）和多標(biāo)簽LSVM，包括在CRIS-C隊(duì)列中的次要分配，顯示出類似的表現(xiàn)（O.R. = 3.36，CI = 1.24-10.64）。
所有這些證據(jù)都證實(shí)了我們的LSVM單樣本模型的預(yù)測結(jié)果的可靠性，特別是mla LSVM，即ML2 CRIS（多標(biāo)簽機(jī)器學(xué)習(xí)CRIS）。ML2 CRIS能夠突出樣本的生物學(xué)內(nèi)在異質(zhì)性（如果有的話），同時(shí)在臨床應(yīng)用中對每個(gè)患者進(jìn)行個(gè)體化評估。這證明了ML2 CRIS在臨床使用環(huán)境中的可靠性。
圖6展示了單標(biāo)簽和多標(biāo)簽CRIS-B分類在預(yù)后方面的意義
參考文獻(xiàn)：
Cascianelli, S., Barbera, C., Ulla, A.A. et al. Multi-label transcriptional classification of colorectal cancer reflects tumor cell population heterogeneity. Genome Med 15, 37 (2023).https://doi.org/10.1186/s13073-023-01176-5