實(shí)驗(yàn)方法：斑馬魚CRISPR/Cas9基因編輯，RNA提取和RNA-seq分析，幼蟲切片免疫熒光染色，?-半乳糖苷酶(?-gal)染色，KEAP1敲除HepG2細(xì)胞系的產(chǎn)生，免疫印跡，siRNA敲低基因，流式細(xì)胞術(shù)，代謝物提取和代謝組學(xué)分析

       氧化還原和代謝穩(wěn)態(tài)的維持對胚胎發(fā)育是不可或缺的。核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2 (NRF2)是一種應(yīng)激誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，在氧化還原平衡和細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)中起核心作用。在穩(wěn)態(tài)條件下，NRF2被Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1 (KEAP1)抑制。我們證明了Keap1缺陷誘導(dǎo)Nrf2激活和發(fā)育后致死。生存能力喪失之前是嚴(yán)重的肝臟異常，其特征是溶酶體的積累。機(jī)制上，我們證明Keap1的缺失會促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子EB (TFEB)/轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到IGHM增強(qiáng)子3 (TFE3)依賴的溶酶體生物發(fā)生的異常激活。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)依賴Nrf2的溶酶體生物發(fā)生調(diào)控是細(xì)胞自主的和進(jìn)化保守的。這些研究確定了KEAP1-NRF2通路在調(diào)節(jié)溶酶體生物發(fā)生中的作用，并表明在胚胎發(fā)育過程中需要維持溶酶體的穩(wěn)態(tài)。本文于2023年5月發(fā)表于Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (IF=12.779)。

本研究的意義：
       KEAP1-NRF2通路在氧化還原平衡和細(xì)胞代謝調(diào)控中起核心作用。盡管NRF2在包括癌癥在內(nèi)的各種疾病狀態(tài)中被廣泛研究，但關(guān)于NRF2在胚胎發(fā)育中的作用的知識卻很缺乏。我們證明NRF2激活誘導(dǎo)致死性，在肝異常和溶酶體積累之前。此外，我們發(fā)現(xiàn)NRF2激活溶酶體生物發(fā)生的主要調(diào)節(jié)因子TFEB/TFE3。這些研究強(qiáng)調(diào)了在胚胎發(fā)育過程中維持溶酶體穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵作用，更廣泛地說，表明異常的溶酶體生物發(fā)生可能是NRF2驅(qū)動的病理的一個(gè)標(biāo)志。

技術(shù)路線：

結(jié)果：
(1) Keap1缺失激活Nrf2并驅(qū)動胚胎后致死
       為了研究Keap1在胚胎發(fā)育過程中的作用，采用了CRISPR/Cas9基因編輯方法(圖S1A-C)。由于硬骨魚譜系中的基因組重復(fù)，斑馬魚有兩個(gè)Keap1類似物(keap1a和keap1b)，它們在Nrf2的調(diào)控方面以冗余的方式起作用。具有keap1a (crkeap1a)、keap1b (crkeap1b)或keap1a/b (crkeap1a/b)嵌合敲除(KO)的Crispants最初在Nrf2報(bào)告者斑馬魚系[Tg(gstp1:EGFP)]中產(chǎn)生，其中EGFP的表達(dá)是由含有ARE的gstp1啟動子驅(qū)動的。在keap1a或keap1b缺失后，Nrf2報(bào)告基因活性沒有顯著變化(圖1A)。相反，crkeap1a/b幼蟲表現(xiàn)出Nrf2激活增加(圖1A)。Nrf2激活在組織中不是均勻的，但在神經(jīng)肥大、嗅腔、耳石、遠(yuǎn)端腸道和肝臟中都有觀察到。Nrf2激活表型遺傳給了雜交的crkeap1a/b系的后代(圖S1D)。與Nrf2報(bào)告基因活性的缺乏一致，RNA-Seq分析在單個(gè)KOs中發(fā)現(xiàn)了有限數(shù)量的差異表達(dá)基因(DEGs)(圖1B)。相比之下，在crkeap1a/b幼蟲中觀察到轉(zhuǎn)錄景觀的廣泛變化(圖1B)。對DEGs中已知基序的超幾何優(yōu)化(HOMER)分析顯示含有ARE的基因富集(圖1C)。此外，NRF2靶基因在DEGs中被過度代表(圖1B,D)。GSEA證實(shí)了與NRF2激活相關(guān)的特征的富集(圖1E)。代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，crkeap1a/b幼蟲中還原型谷胱甘肽的豐度顯著增加(圖1F和圖S1E)。與Keap1缺失相關(guān)的分子特征導(dǎo)致胚胎后發(fā)育期間存活率顯著下降(圖1G)，這與在Keap1缺失小鼠中觀察到的胚胎后致命性一致。這些數(shù)據(jù)表明，斑馬魚中keap1a和keap1b的復(fù)合缺失為研究KEAP1-NRF2通路在發(fā)育過程中的作用提供了一個(gè)強(qiáng)有力的模型。

圖1：Keap1缺失激活Nrf2并驅(qū)動胚胎后死亡

(2) 缺乏Keap1的幼蟲在胚胎后肝臟發(fā)育中表現(xiàn)出缺陷
       對crkeap1a/b斑馬魚的進(jìn)一步分析顯示，Nrf2報(bào)告基因活性在肝臟中最高(圖2A)。除了Nrf2激活增加外，crkeap1a/b幼蟲的肝臟形態(tài)也發(fā)生了改變。具體來說，與多葉野生型(WT)肝臟相比，crkeap1a/b肝臟表現(xiàn)為單個(gè)液滴狀葉(圖2A)。接下來，利用肝細(xì)胞報(bào)告細(xì)胞系(Tg(lf:NLS-mcherry))特異性檢測肝細(xì)胞中的Nrf2活性。雖然crkeap1a/b幼蟲的肝臟體積和肝細(xì)胞數(shù)量沒有變化，但肝細(xì)胞中Nrf2活性顯著增加(圖2B,C和圖S2A,B)。流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)，從crkeap1a/b幼蟲分離的肝細(xì)胞中Nrf2報(bào)告細(xì)胞活性升高(圖2D)。組織學(xué)評估顯示，肝細(xì)胞核的竇狀竇變寬，大小增加(圖2E和圖S2C)。Nrf2和血管報(bào)告基因聯(lián)合背景下crkeap1a/b幼蟲的多光子分析[Tg(gstp1:EGFP;kdrl:mCherry)]證實(shí)血管舒張(圖S2D)。重要的是，在血管系統(tǒng)中未觀察到Nrf2活性(圖S2D)。總的來說，這些研究表明肝細(xì)胞對Keap1的缺失很敏感。

圖2：缺乏Keap1的幼蟲在胚胎后肝臟發(fā)育中表現(xiàn)出缺陷

(3) 丟失Keap1誘導(dǎo)溶酶體生物發(fā)生
       GSEA在crkeap1a/b幼蟲中觀察到的最富集的途徑之一是KEGG溶酶體特征(圖3A)。事實(shí)上，在Keap1缺失的情況下，許多溶酶體基因的表達(dá)，包括?-半乳糖苷酶(?-gal)和多種組織蛋白酶的表達(dá)顯著增加(圖3B)。在解剖的幼蟲肝組織中，溶酶體特征也高度富集(圖3C)。顯示單個(gè)膜結(jié)合囊泡增加，表明溶酶體豐度增加(圖S3A)。為了直接觀察肝臟中的溶酶體，一種肝細(xì)胞特異性溶酶體報(bào)告基因[Tg(lf:Lamp1-mGreenLantern; lf:mKate2-CAAX)]。在這條線中，由于Keap1的缺失，觀察到溶酶體豐度急劇增加(圖3D,E)。為了觀察整個(gè)幼蟲的溶酶體活性，進(jìn)行了?-gal染色。與WT幼蟲在富含溶酶體的腸細(xì)胞中呈現(xiàn)?-gal染色相反，crkeap1a/b幼蟲在肝臟中呈現(xiàn)強(qiáng)烈的?-gal染色(圖3F,G)。雖然?-gal染色被用作溶酶體活性的測量，但它也被用作細(xì)胞衰老的替代標(biāo)記。因此，采用正交試驗(yàn)來排除衰老在Keap1缺陷表型中的作用。衰老的一個(gè)特征是p53依賴的細(xì)胞周期停滯。在crkeap1a/b肝細(xì)胞中，?-gal和增殖細(xì)胞核抗原共染色未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯的證據(jù)(圖S3B)。此外，p53的丟失并不影響?-gal染色(圖S3C,D)。對RNA-Seq數(shù)據(jù)集的進(jìn)一步分析顯示，在crkeap1a/b幼蟲肝臟和整個(gè)幼蟲中觀察到的DEGs中缺乏與衰老相關(guān)的分泌表型因子(圖S3E,F)。這些數(shù)據(jù)表明，由于Keap1的丟失，溶酶體的生物發(fā)生增加。
       溶酶體基因的表達(dá)和溶酶體生物發(fā)生的調(diào)控由MiT/TFE轉(zhuǎn)錄因子家族成員控制，其中包括TFEB和TFE3。濾泡素(FLCN)的缺失通過促進(jìn)TFEB/TFE3的激活來刺激溶酶體的生物生成。采用CRISPR/Cas9基因編輯方法比較丟失Keap1或Flcn后觀察到的發(fā)育表型。flcn (crflcn)在肝細(xì)胞特異性溶酶體報(bào)告者背景上的鑲嵌KO復(fù)制了在crkeap1a/b幼蟲中觀察到的溶酶體豐度和活性的增加(圖3H-K和圖S3G-I)。有趣的是，F(xiàn)lcn或Keap1的缺失與相似發(fā)育階段的死亡率相關(guān)，這表明溶酶體生物發(fā)生的失調(diào)可能導(dǎo)致胚胎后死亡(圖S3J)。

圖3：丟失Keap1誘導(dǎo)溶酶體生物發(fā)生

(4) Bach1介導(dǎo)的Nrf2抑制調(diào)節(jié)溶酶體生物發(fā)生
       除了NRF2調(diào)控的基因富集外，HOMER de novo基序分析發(fā)現(xiàn)BTB結(jié)構(gòu)域和CNC同源物1 (BACH1)是crkeap1a/b幼蟲中最富集的基序之一(圖1C)。BACH1是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，通過與MAF識別元件(MARE)結(jié)合來調(diào)節(jié)血紅素代謝。由于MARE和ARE基序的相似性，已知NRF2靶基因的一個(gè)子集受BACH1的共同調(diào)控。為了探索BACH1在KEAP1調(diào)節(jié)的溶酶體生物發(fā)生中的作用，我們在Tg(gstp1:EGFP; lf:NLS-mcherry)背景(圖S4A)。在WT背景下，Bach1的缺失對Nrf2報(bào)告基因活性沒有影響(圖4A)。RNA-Seq分析證實(shí)Bach1缺失并不足以誘導(dǎo)NRF2轉(zhuǎn)錄程序(圖4B)。然而，在Keap1缺乏的情況下，Bach1的缺失加劇了Nrf2報(bào)告基因的活性(圖4A)，這反映在Nrf2靶基因表達(dá)的增強(qiáng)上(圖4B,C)。此外，GSEA顯示，在Bach1 DKO中，多個(gè)特征的標(biāo)準(zhǔn)化富集得分更高，包括KEGG溶酶體特征；crkeap1a/b復(fù)合突變體相對于crkeap1a/b突變體幼蟲(圖1E,3A,4C和圖S4B)。?-gal染色證實(shí)Bach1 DKO溶酶體生物發(fā)生顯著增加；crkeap1a/b幼蟲(圖4D,E)。重要的是，Bach1的缺失加速了Keap1依賴性的胚胎后致死(圖4F)。這些結(jié)果表明，在胚胎發(fā)育過程中，BACH1有助于抑制NRF2的活性。

圖4：Bach1介導(dǎo)的Nrf2抑制調(diào)節(jié)溶酶體的生物發(fā)生

(5) 依賴Keap1的溶酶體生物發(fā)生調(diào)控需要Nrf2
       為了確定在KEAP1缺乏的情況下溶酶體生物發(fā)生是否需要NRF2，我們利用了先前報(bào)道的NRF2突變系(nfe2l2^fh318)。在NRF2突變背景下，Keap1缺失未能誘導(dǎo)NRF2轉(zhuǎn)錄程序(圖S5A)。此外，Nrf2活性的喪失抑制了crkeap1a/b幼蟲中溶酶體基因表達(dá)的增加(圖5A)。此外，在Nrf2突變背景下，crkeap1a/b幼蟲中觀察到的?-gal染色增加和胚胎后致死(圖5B-D)。這些結(jié)果表明，依賴Keap1的溶酶體生物發(fā)生和胚胎后致死依賴于NRF2。

圖5：依賴Keap1的溶酶體生物發(fā)生調(diào)節(jié)需要Nrf2

(6) 依賴Keap1的溶酶體生物發(fā)生調(diào)控是細(xì)胞自主的和進(jìn)化保守的
       為了確定KEAP1對溶酶體生物發(fā)生的調(diào)節(jié)是否以細(xì)胞自主和進(jìn)化保守的方式發(fā)生，我們還利用哺乳動物細(xì)胞研究了KEAP1缺失的影響?？紤]到KEAP1缺失主要影響體內(nèi)肝臟(圖2)，我們采用肝細(xì)胞系(HepG2)。使用CRISPR/Cas9基因編輯方法生成KEAP1 KO HepG2細(xì)胞。與體內(nèi)數(shù)據(jù)一致，KEAP1的缺失導(dǎo)致NRF2表達(dá)和GSH含量顯著增加(圖6A和圖S6A)。此外，KEAP1的缺失與?-gal染色顯著增加相關(guān)(圖6B,C)。KEAP1 KO HepG2細(xì)胞也表現(xiàn)出組織蛋白酶活性升高和溶酶體豐度增加，分別使用Magic Red組織蛋白酶活性測定和嗜酸性染料溶酶體檢測(圖6D和圖S6B)。為了檢驗(yàn)TFEB/TFE3在KEAP1 KO細(xì)胞中的作用，在沒有或存在siRNA介導(dǎo)的TFEB和TFE3敲低的情況下進(jìn)行了RNA-Seq分析(圖S6C)。NRF2靶基因和溶酶體基因在KEAP1 KO HepG2細(xì)胞中上調(diào)(圖6E和圖S6C)。此外，GSEA還揭示了NRF2通路特征和KEGG溶酶體特征的富集(圖6F)。重要的是，TFEB/TFE3敲低抑制了KEAP1 KO HepG2細(xì)胞中溶酶體基因的表達(dá)，而對NRF2靶基因的表達(dá)沒有任何影響(圖6E,F和圖S6D)。與溶酶體基因表達(dá)增加一致，KEAP1 KO細(xì)胞中觀察到TFEB/TFE3的核定位升高(圖6G)。對來自the Cancer Genome Atlas數(shù)據(jù)庫的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分析顯示，NRF2靶基因PRDX1和TXN的表達(dá)與TFEB/TFE3靶基因ATP6V0B和GLA的表達(dá)之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性(圖6H,I和圖S6E)。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明KEAP1缺失以細(xì)胞自主和進(jìn)化保守的方式誘導(dǎo)TFEB/TFE3依賴性溶酶體程序。

圖6：依賴Keap1的溶酶體生物發(fā)生調(diào)控是細(xì)胞自主的，并且在進(jìn)化上是保守的

結(jié)論：本研究揭示KEAP1缺失促進(jìn)溶酶體生物發(fā)生。機(jī)制上，我們提供了NRF2激活保守的TFEB/TFE3依賴程序的證據(jù)。鑒于KEAP1和NRF2在癌癥中經(jīng)常發(fā)生突變，探索TFEB/TFE3在NRF2驅(qū)動的癌癥中的作用將是有趣的。

參考文獻(xiàn)：Ong, A. J. S., Bladen, C. E., Tigani, T. A., Karamalakis, A. P., Evason, K. J., Brown, K. K., & Cox, A. G. (2023). The KEAP1-NRF2 pathway regulates TFEB/TFE3-dependent lysosomal biogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 120(22), e2217425120. https://doi.org/10.1073/pnas.2217425120.