索拉非尼是一種酪氨酸激酶抑制劑，在包括胃癌(GC)在內(nèi)的多種癌癥中作為鐵死亡誘導劑具有重要的抗腫瘤作用。然而，索拉非尼作為鐵死亡誘導劑的地位最近受到了質(zhì)疑。關于鐵死亡與ATF2之間關系的信息非常有限，ATF2在索拉非尼誘導的鐵死亡中的作用尚未被研究。在本研究中，我們研究了ATF2在索拉非尼誘導的胃癌鐵死亡中的作用和潛在的分子機制。我們發(fā)現(xiàn)ATF2在胃癌組織中顯著上調(diào)，預示著較差的臨床預后。沉默ATF2可顯著抑制GC細胞的惡性表型。此外，我們觀察到ATF2在索拉非尼誘導的GC細胞鐵死亡過程中被激活。ATF2敲低促進索拉非尼誘導的鐵死亡，而ATF2過表達在GC細胞中顯示相反的結果。通過ChIP-Seq和RNA-Seq，我們確定HSPH1為ATF2的靶點，并通過ChIP-qPCR分析進一步驗證。HSPH1可以與SLC7A11相互作用，提高其蛋白穩(wěn)定性。重要的是，HSPH1的下調(diào)部分逆轉了ATF2過表達對索拉非尼誘導的GC細胞鐵死亡的影響。此外，來自異種移植瘤模型的結果表明，ATF2的下調(diào)可以有效地增強索拉非尼在體內(nèi)的敏感性。總的來說，我們的研究揭示了索拉非尼誘導GC鐵死亡的一種新機制。本文于2022年12月發(fā)表于“Redox Biology”（IF=10.787）上。

技術路線

結果

1）ATF2在胃癌中表達上調(diào)，預示預后不良

為了研究ATF2在胃癌中的表達模式，我們首先利用TCGA數(shù)據(jù)庫。結果表明，ATF2 mRNA在GC組織中的表達明顯高于正常組織(圖1A)。ATF2在GC細胞系(SGC7901、HGC27、AGS、MGC803和MKN45)中的表達高于非惡性細胞系(GES-1；圖1B)。另外，我們在12對新鮮GC組織和相鄰正常組織中檢測了ATF2蛋白的表達，也發(fā)現(xiàn)了相似的結果，ATF2在GC組織中表達增加(圖1C)。我們還用免疫組化方法在包含107個GC組織和22個相鄰正常組織的TMA上評估了ATF2的表達。不同ATF2表達水平的代表性圖像如圖1D所示。值得注意的是，61.7%(66/107)的GC組織中ATF2蛋白高表達，而63.6%(14/22)的相鄰正常組織中ATF2蛋白低表達(圖1E)。總生存期(OS)分析表明，ATF2表達升高的GC患者生存時間較ATF2表達降低的GC患者短(圖1F)。同樣，在一個大隊列中驗證了高ATF2表達與不良預后相關(圖1G)。這些結果表明ATF2在GC中表達上調(diào)，是OS有價值的預測生物標志物。

2）ATF2表達下調(diào)可抑制GC細胞惡性表型

為了闡明ATF2在GC中的作用，我們通過一系列功能實驗進行了進一步研究。首先，根據(jù)ATF2在GC細胞系中的表達水平，我們選擇MGC803細胞系敲低ATF2，選擇AGS細胞系過表達ATF2。qRT-PCR和western blot分析證實了ATF2下調(diào)和過表達的有效性(圖2A和B)。CCK-8實驗結果顯示，ATF2下調(diào)顯著降低了細胞增殖能力，但過表達ATF2沒有明顯影響(圖2C和D)。如圖2E所示，ATF2過表達顯著增強了GC細胞的遷移能力，但對GC細胞的侵襲性沒有影響。值得注意的是，ATF2下調(diào)顯著降低了GC細胞的遷移和侵襲能力(圖2F)。綜上所述，這些結果表明，ATF2下調(diào)在體外對GC細胞惡性表型的影響要比ATF2過表達大得多。

3）索拉非尼誘導GC細胞鐵死亡并激活ATF2表達

我們研究了索拉非尼是否誘導GC細胞鐵死亡。如圖3A所示，10 μM 索拉非尼作用24 h后，AGS和MGC803細胞形態(tài)均出現(xiàn)萎縮，呈圓形，排列松散。與對照組相比，索拉非尼治療導致總細胞ROS和脂質(zhì)ROS增加(圖3B和C)。此外，索拉非尼處理導致MDA顯著增加，但谷胱甘肽減少，F(xiàn)er-1有效地抑制了這種效應(圖3D和E)。考慮到鐵死亡與線粒體功能密切相關，我們接下來研究了線粒體膜電位(MMP)和形態(tài)的變化。JC-1染色結果顯示，與對照組相比，索拉非尼處理后MMP明顯降低(圖4A)。此外，TEM顯示索拉非尼處理后MGC803細胞線粒體嵴明顯減少或缺失，線粒體膜密度增加(圖4B)。這些結果表明索拉非尼可誘導GC細胞鐵死亡。作為一種關鍵的應激反應轉錄因子，ATF2在索拉非尼誘導的鐵死亡中的表達變化尚不清楚。如圖4C所示，索拉非尼治療增加了ATF2的表達，尤其是磷酸化形式。免疫熒光顯示，索拉非尼刺激后，ATF2在細胞核中表達更高(圖4D)。因此，索拉非尼誘導的鐵死亡可能促進ATF2核易位，增強ATF2在GC細胞中的轉錄活性。

4）ATF2下調(diào)增強索拉非尼誘導的GC細胞鐵死亡

為了了解ATF2在索拉非尼誘導的鐵死亡中的作用，我們調(diào)節(jié)ATF2表達水平并評估其對鐵死亡的影響。我們發(fā)現(xiàn)，與載體細胞相比，ATF2過表達導致AGS細胞中索拉非尼的IC50值升高，而ATF2下調(diào)導致MGC803細胞中索拉非尼的IC50值降低(圖5A)。索拉非尼處理和ATF2下調(diào)均使總細胞ROS和脂質(zhì)ROS升高，ATF2下調(diào)導致AGS細胞進一步升高，而ATF2過表達抑制了MGC803細胞中索拉非尼誘導的升高(圖5B和C)。同樣，在索拉非尼處理的GC細胞中，ATF2過表達導致MDA減少，GSH增加，而ATF2下調(diào)則顯示相反的結果(圖5D和E)。透射電鏡結果表明，在索拉非尼治療后，ATF2下調(diào)的GC細胞線粒體減少，膜密度增加，嵴退化，這種作用被ATF2過表達部分逆轉(圖5F)。這些結果表明，ATF2過表達抑制了索拉非尼誘導的GC細胞鐵死亡。

5）ATF2激活GC細胞中HSPH1的轉錄

為了進一步闡明潛在的機制，我們進行了RNA-seq和ChIP- seq來鑒定ATF2的全基因組DNA結合位點和潛在的轉錄靶點。如圖6A所示，RNA-seq分析顯示，與對照組相比，MGC803細胞在敲除ATF2后，上調(diào)了1059個基因，下調(diào)了370個基因。RNA-seq數(shù)據(jù)的通路富集分析表明，ATF2敲低顯著影響了鐵死亡通路(圖6B)。接下來，ChIP-seq共鑒定出24119個峰，對應3641個RefSeq基因，其中2.88%位于啟動子轉錄起始位點(圖6C)。在染色體上觀察到不同的峰值，并掃描峰值之間共享的motif(圖6D和E)。我們將RNA-seq和ChIP-seq數(shù)據(jù)進行交集分析，篩選出了222個ATF2直接調(diào)控的候選轉錄靶點(圖7A)，其中HSPH1在ATF2敲除后顯著下調(diào)(圖7B)。在TCGA數(shù)據(jù)集中，HSPH1在GC中的表達與ATF2呈顯著正相關(圖7C)。如圖7D所示，ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示HSPH1啟動子區(qū)(13號染色體位置31,162,322-31,162,573)存在顯著的ATF2結合峰。因此，我們推測HSPH1可能是ATF2的潛在靶基因。western blot分析結果顯示，過表達ATF2后HSPH1升高，敲低ATF2后HSPH1降低(圖7E)，并且ChIP-qPCR進一步證實ATF2可以結合HSPH1的啟動子區(qū)(圖7F)。這些數(shù)據(jù)說明ATF2可以通過結合啟動子激活HSPH1的表達。

6）GC中HSPH1與SLC7A11相互作用并增加其穩(wěn)定性

鑒于熱休克蛋白在鐵死亡中的突出作用，我們試圖確定HSPH1是否可能影響GC中SLC7A11的表達。我們首先查詢GeneMANIA數(shù)據(jù)庫，預測并顯示了HSPH1與SLC7A11之間潛在的相互作用(圖8A)。為了驗證這一預測，我們進一步進行co-IP實驗，確定HSPH1與SLC7A11存在物理相互作用(圖8B)。接下來，我們用siRNA敲低HSPH1的表達(圖8C)，并將HSPH1 siRNA轉染到ATF2穩(wěn)定過表達的AGS細胞中。有趣的是，我們觀察到HSPH1的敲除降低了SLC7A11蛋白表達水平(圖8D)。因此，我們進行了CHX追蹤實驗來表征在HSPH1敲除或不敲除情況下SLC7A11蛋白的半衰期。Western blot分析表明，與對照組相比，抑制HSPH1加速了AGS細胞中SLC7A11蛋白的降解(圖8E)。這些結果表明，HSPH1可以與SLC7A11相互作用，并通過至少部分地增加SLC7A11蛋白的穩(wěn)定性來增加其表達。接下來，我們發(fā)現(xiàn)HSPH1的下調(diào)部分消除了ATF2過表達對細胞ROS和脂質(zhì)ROS的影響(圖8F和G)。一致地，與HSPH1 siRNA共轉染顯著逆轉了ATF2過表達對鐵死亡中MDA和GSH水平的影響(圖8H和I)。這些結果為ATF2通過HSPH1調(diào)節(jié)索拉非尼誘導的GC細胞鐵死亡提供了證據(jù)。

7）ATF2下調(diào)增加GC在體內(nèi)對索拉非尼的敏感性

為了評估單獨下調(diào)ATF2和聯(lián)合索拉非尼對體內(nèi)GC的影響，建立裸鼠異種移植模型(圖9A)。穩(wěn)定的ATF2下調(diào)細胞形成的腫瘤始終比對照GC細胞形成的腫瘤更小、更輕，說明ATF2下調(diào)可有效抑制體內(nèi)腫瘤的生長(圖9B)。ATF2下調(diào)聯(lián)合索拉非尼治療后，皮下腫瘤的體積和重量均顯著降低(圖9C和圖D)。為了更好地觀察潛在的鐵死亡，皮下腫瘤切片用脂質(zhì)過氧化的敏感標記4-HNE染色。IHC染色顯示sh-ATF2 +索拉非尼組4-HNE的表達最高(圖9E)。因此，ATF2的下調(diào)增強了索拉非尼在體內(nèi)對GC的抗腫瘤作用。

結論:我們發(fā)現(xiàn)索拉非尼激活ATF2的表達，并進一步促進HSPH1的表達，降低SLC7A11蛋白的降解，從而達到抗脂質(zhì)過氧化的保護作用。我們研究證明促進索拉非尼誘導的鐵死亡可能是一種有前途的GC治療新策略。

參考文獻：

Xu X, Li Y, Wu Y, Wang M, Lu Y, Fang Z, Wang H, Li Y. Increased ATF2 expression predicts poor prognosis and inhibits sorafenib-induced ferroptosis in gastric cancer. Redox Biol. 2022 Dec 2;59:102564. doi: 10.1016/j.redox.2022.102564.