盡管在高級別星形細胞瘤(HGA)的組織病理學診斷方面取得了重大進展，但有效的非侵入性診斷方法在很大程度上仍然未知。外泌體可以穿過血腦屏障，在人類生物液體中很容易獲得，使它們成為HGA的有前途的生物標志物。環狀RNA(circRNAs)由于其穩定性、保守性和組織特異性，具有作為腫瘤生物標志物的潛力。然而，外泌體circRNAs在HGA中的分布和特征仍有待研究。該研究于2022年2月發表在《Clinical Chemistry》，IF：12.167。

技術路線

研究結果

1原代HGA細胞和配對外泌體的circRNA圖譜特征

CircRNAs是由癌細胞中的外泌體分泌到血液、尿液、母乳和唾液等體液中。血清外泌體取決于分泌細胞的來源。因此，從新病理診斷的HGA樣本(WHO分級IV)中培養3個原代腫瘤細胞(圖1A-C)。接下來檢查HGA樣本和原發腫瘤細胞的重要分子特征。結果發現3種HGA組織的分子模式相似，在所有3個原發腫瘤細胞中均出現異檸檬酸脫氫酶1突變，O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶甲基化雜合子模式缺失1p(圖1D-G)。從3個原代培養的HGA細胞(T01,T03和T05)及其配對的細胞衍生外泌體(T02,T04和T06)中使用特定的circRNA深度測序對circRNA轉錄物進行了描述(圖1H-J)。

圖1 原代HGA細胞的分析特征

在原代HGA細胞和配對的細胞衍生外泌體中，總共發現了8117和2633個circRNA，與外泌體相比，HGA細胞中的circRNA濃度增加(每10億個mapping reads的剪接reads的平均值[SRPBM])(圖2A)。其次，與HGA細胞circRNA的基因組位置一致，觀察到HGA細胞衍生的外泌體circRNA主要來自外顯子區域(分別為87.53%和88.23%)，而其他circRNA則來自內含子區域(分別為9%和8.5%)和基因間區域(分別為3.47%和3.27%)(圖2B)。26個高水平細胞circRNA產生宿主基因(上)和12個高水平外泌體circRNA產生宿主基因(下)的GO注釋如圖2C。HGA細胞circRNA(上)和HGA細胞衍生的外泌體circRNA(下)的染色體分布如圖2D。接著發現HGA細胞衍生的外泌體circRNA的濃度與HGA細胞circRNA的濃度只是適度相關(圖2E)。大多數外顯子circRNA長度不超過1000 nt，而51.16%的內含子circRNA和52.23%的基因間circRNA長度超過3000 nt(圖2F)。

圖2 原代HGA衍生的外泌體circRNAs的分析特征

2 腫瘤細胞的高水平短外顯子circRNAs更容易在外泌體中富集

26個高表達的circRNAs共存于3個腫瘤細胞的circRNAs中，產生這26個富集的circRNAs的宿主基因具有獨特的分子功能和特征。真核生物同源組(KOG)分析顯示，最豐富的類別是“general functional prediction only”，其次是“signal transduction mechanisms”(圖3A)。進一步研究了12種circRNAs是否普遍富集于3個HGA細胞配對的外泌體中，宿主基因KOG分析顯示，最大的KOG群是“general functional prediction only”和“cytoskeleton”(圖3B)。有趣的是，幾乎所有高水平HGA細胞衍生的外泌體circRNAs都包含在HGA細胞circRNAs中(圖3C)。還發現這11個circRNAs起源于外顯子區域(11/11)。CircRNAs的長度在200-1400 nt之間，63.63%的circRNAs長度約為400 nt(圖3D)。圖3E表明高通量測序和qRT-PCR的結果基本一致。以上數據支持HGA細胞高表達和短外顯子的circRNAs更容易在外泌體中富集，并且這些circRNAs的含量在外泌體中極度富集。此外，在原代HGA細胞T03中未發現外泌體T04中的122個circRNAs，在原代HGA細胞T05中未發現外泌體T06中的79個circRNAs(圖3F)。作者推測外泌體中可能存在circRNA剪接/形成的機制，值得進一步探索和驗證。

圖3 不同circRNAs分類的特征與功能分析

3 組織circRNAs在HGA預后監測中的應用

發現2633個circRNAs被包裝在3個原代HGA腫瘤細胞源性外泌體中，然而無法確定circRNAs在HGA腫瘤組織和正常組織中是否存在差異。首先，在HGA細胞衍生的外泌體中隨機選擇32個circRNAs，檢測其在30例HGA患者和12例正常人中的表達(圖4A)。與正常組織相比，幾乎所有32種circRNAs在腫瘤組織中的表達濃度都較低。8個外顯子circRNAs在兩種組織類型中的表達差異非常顯著(圖4B)。circRNAs hsa_circ_0005019、hsa_circ_0000880、hsa_circ_0051680和hsa_circ_0006365可以作為HGA的預后標志物，這些circRNAs的高表達預示著HGA患者預后良好(圖4C)。

圖4 CircRNAs在HGA預后中作為組織活檢靶點

4、血清外泌體circRNAs在液體活檢中用于HGA的早期篩查

作者檢測了HGA患者和健康人的血清外泌體中32種選定的circRNAs的表達(圖5A)。3種circRNAs(上調的hsa_circ_0075828、下調的hsa_circ_0003828和下調的hsa_circ_0002976)在正常和HGA血清外泌體中的表達差異最大(圖5B)。計算了用于HGA檢測的這些circRNAs曲線下的面積。hsa_circ_0075828、hsa_circ_0002976和hsa_circ_0003828的曲線值下面積在0.8111到0.9861之間(圖5C)。這3種circRNAs可準確區分HGA患者(30例)與健康個體(12例) (表1)。總之，circRNA hsa_circ_0075828、hsa_circ_0002976和hsa_circ_0003828的組合可以作為外泌體circRNA面板，用于HGA的敏感和精確篩選。

圖5 血清外泌體circRNAs在HGA診斷中作為液體活檢靶點

結論

這項研究揭示了HGA外泌體和細胞中全面的circRNAs景觀。血清外泌體circRNAs、外泌體circRNAs面板和組織circRNAs對HGA液體活檢和預后監測具有潛在的作用。外泌體circRNAs作為新的靶點，有助于進一步發現生物標志物，并有助于HGA的診斷和治療監測。