circRNAs已被證明有助于食管癌的進展。生物信息學分析預測circBCAR3在食管癌中存在差異表達。我們研究了circBCAR3在食管癌發生中的致癌作用和生物發生。circBCAR3在食管癌組織和細胞中高表達，體外缺氧使其表達增加。沉默circBCAR3可抑制食管癌細胞的增殖、遷移、侵襲和鐵死亡，抑制小鼠體內腫瘤的生長和轉移。缺氧誘導的食管癌細胞遷移和鐵死亡的促進作用通過下調circBCAR3得以恢復。在機制上，剪接因子QKI促進circBCAR3的生物發生，通過與miR-27a-3p結合上調TNPO1，加速食管癌的發生。這些數據提示circBCAR3可能是食管癌治療的一個潛在靶點。本文于2022年7月發表于“Molecular Cancer”（IF=41.444）上。

技術路線

結果

1）CircBCAR3在食管癌組織和細胞中表達上調

為了了解circBCAR3在食管癌中的表達情況，我們首先從GEO數據庫中分析了circRNAs在食管癌中的表達情況。基于GSE150476和GSE112496數據集，有5個circRNAs在食管癌中存在差異表達(圖1A)。為了探索缺氧條件下食管癌中這些異常circRNAs的表達是否會發生改變，我們檢測了缺氧處理后EC109細胞中它們的表達水平。Hsa_circ_0007624在缺氧處理后被發現上調(圖1B)。通過PCR證實hsa_circ_0007624 (circBCAR3)表達上調，結果顯示circBCAR3在食管癌腫瘤樣本和細胞系中表達明顯升高(圖1C, D)，BCAR3 pe-mRNA的2,3,4,5外顯子反向拼接形成circBCAR3的閉環結構(圖1E)。環狀(circBCAR3)對RNase R的抗性更強，而線性形式(BCAR3 mRNA)顯著衰減(圖1F)。此外，經轉錄抑制劑放線菌素D處理后，circBCAR3的轉錄半衰期長于BCAR3 mRNA，這表明circBCAR3的穩定性高于BCAR3 mRNA(圖1G)。circBCAR3由cDNA中的發散引物擴增，證實了環狀BCAR3外顯子的存在，并排除了反式剪接產物(圖1H)。隨后對EC109和KYSE150細胞進行了RNA-FISH檢測，結果顯示circBCAR3主要存在于食管癌細胞的細胞質中(圖1I)。

2）CircBCAR3敲低可抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲

為了研究circBCAR3在食管癌發生發展中的作用，我們設計了兩個shRNAs，在EC109和KYSE150細胞中有效地沉默circBCAR3(圖2A)。CCK-8、克隆形成實驗和EdU實驗顯示沉默的circBCAR3抑制了EC109和KYSE150細胞的活力和增殖(圖2B-D)。創面愈合實驗和transwell實驗(包括遷移和侵襲)表明，下調circBCAR3抑制食管癌細胞的遷移和侵襲能力(圖2E, F)。

3）CircBCAR3敲低可以抑制食管癌細胞鐵死亡

進一步探討了circBCAR3敲除對鐵死亡的影響。如圖3A-D所示，sh-circBCAR3降低了細胞內Fe2+、MDA、脂質ROS，并增加了GSH水平。透射電鏡觀察到sh-circBCAR3在食管癌細胞中減少鐵死亡的典型形態變化(圖3E)。如圖3F所示，沉默circBCAR3后，GPX4蛋白水平升高。

4）CircBCAR3敲低逆轉了缺氧對食管癌細胞增殖、遷移、侵襲和鐵死亡的影響

我們進行功能研究以評估circBCAR3是否介導缺氧誘導的食管癌細胞惡性行為的改變。結果表明，缺氧處理可顯著促進食管癌細胞的增殖、遷移、侵襲和鐵死亡。CircBCAR3敲除顯著逆轉了缺氧的這些效應(圖4)。

5）沉默的circBCAR3在體內抑制食管癌的腫瘤生長和轉移

為了研究circBCAR3在體內腫瘤生長和轉移中的作用，我們通過注射穩定表達sh-nc和sh-circBCAR3的細胞建立小鼠食管異種移植瘤。結果表明，circBCAR3缺乏降低了小鼠食管腫瘤的體積和重量(圖5A-C)。免疫組化染色結果表明，沉默的circBCAR3可降低增殖標志物ki67的表達。H&E染色結果顯示，sh-nc組腫瘤細胞分布密集，細胞形態正常，而sh-circBCAR3組腫瘤細胞數量減少，細胞核縮小較多(圖5D)。隨后，我們建立了腫瘤轉移模型，通過尾靜脈注射食管癌細胞來監測肺轉移。生物發光圖像顯示沉默的circBCAR3誘導小鼠的腫瘤抑制，這可以從生物發光強度的下降中得到證明(圖5E)。與對照組相比，沉默circBCAR3抑制食管癌肺轉移(圖5F)。H&E染色結果進一步證實了這一趨勢(圖5G)。免疫組化染色顯示，敲除circBCAR3可以抑制肺組織中波形蛋白、N-cadherin、MMP-2、MMP-9的表達，促進E-cadherin的表達(圖5H)。這些數據表明，在體內，circBCAR3的下調可以減弱食管癌的生長和轉移。

6）在食管癌細胞中circBCAR3負向調控miR-27a-3p

從ENCORI數據庫中預測與circBCAR3結合的潛在miRNAs。我們關注miR-27a-3p是因為它的高排名。miR-27a-3p與circBCAR3的結合位點如圖6A所示。熒光素酶實驗結果顯示，circBCAR3負調控野生型miR-27a-3p(圖6B)。RIP實驗顯示，Ago2是miRNA機制的效應物，可以與miR-27a-3p和circBCAR3結合(圖6C, D)。與對照組相比，在EC109和KYSE150細胞中轉染circBCAR3 shRNAs可提高miR-27a-3p的表達水平，過表達circBCAR3可降低miR-27a-3p的表達水平(圖6E)。此外，為了確定circBCAR3和miR-27a-3p在食管癌細胞中的亞細胞分布，我們進行了RNA-FISH實驗，結果表明circBCAR3和miR-27a-3p均位于細胞質中(圖6F)。

7）TNPO1在食管癌細胞中是miR-27a-3p的靶點

通過ENCORI數據庫，確定TNPO1、GCC2、THRB和CASC3為miR-27a-3p的潛在靶點。miR-27a-3p導致EC109細胞中TNPO1表達降低(圖7A)。與對照Het-1A細胞系相比，6個食管癌細胞中TNPO1顯著上調(圖7B)。我們還發現，GEPIA數據庫中182個食管癌組織中TNPO1的表達高于286個鄰近非腫瘤組織(圖7C)。根據ENCORI數據庫的預測，TNPO1 3’UTR與miR-27a-3p序列互補(圖7D)。熒光素酶實驗證實TNPO1是miR-27a-3p的直接靶點(圖7E)。MiR-27a-3p模擬物能有效降低TNPO1的表達水平，而MiR-27a-3p抑制劑能顯著增強TNPO1的表達水平(圖7F)。缺氧可誘導食管癌細胞中TNPO1表達上調(圖7G)。PCR結果顯示，TNPO1在45個食管癌組織中顯著高表達(圖7H)。

8）TNPO1過表達挽救了沉默的circBCAR3介導的對食管癌細胞增殖、遷移、侵襲和鐵死亡的抑制

我們設計了TNPO1過表達載體，發現它有效地拯救了sh-circBCAR3對TNPO1表達的抑制作用(圖8A)。EdU分析和集落形成實驗表明，circBCAR3 shRNA降低了細胞活力和增殖，TNPO1過表達進一步提高了細胞活力和增殖(圖8B-C)。Transwell遷移和侵襲實驗表明，TNPO1過表達挽救了敲低circBCAR3對細胞遷移和侵襲能力的抑制作用(圖8D)。圖9顯示，sh-circBCAR3對食管癌細胞鐵死亡的抑制作用被TNPO1的過表達所拯救。

9）剪接因子QKI加速了circBCAR3的生物發生

為了確定circBCAR3形成的調控機制，我們針對MEX3A、MEX3B、QKI、ESRP1、ESRP2、NOVA1、NOVA2等剪接因子設計shRNAs，檢測轉染這些shRNAs后circBCAR3的表達。PCR分析結果顯示，剪接因子QKI和ESRP1負向調控食管癌細胞中circBCAR3的表達，而其他剪接因子對circBCAR3的表達無明顯影響(圖10A)。接下來，我們揭示了circBCAR3形成BCAR3外顯子的側翼的5個QKI結合序列(圖10B)。使用QKI抗體的RIP實驗表明，QKI在a、b、e和f位點與BCAR3 pre-mRNA結合(圖10C)。此外，QKI在我們收集的45個食管癌組織中表達上調(圖10D)。QKI敲低可以抑制circBCAR3的表達，而對BCAR3 mRNA的表達沒有影響(圖10E)。這些發現表明，剪接因子QKI通過內含子中的結合位點加速了circBCAR3的生物發生。

10）缺氧誘導E2F7表達激活QKI轉錄

缺氧如何誘導circBCAR3表達升高尚不清楚。因此，我們使用RNA-seq來篩選異常基因，如熱圖和火山圖所示(圖11A, B)。富集分析顯示E2F家族的基因被富集(圖11C)。我們通過檢索GEPIA數據庫來探討這些E2Fs在食管癌中的表達。有趣的是，我們發現E2F7在食管癌中顯著高表達(圖11D)。PCR分析證實，缺氧處理后EC109細胞中E2F7和QKI表達均上調(圖11E)。由于E2F7是一個轉錄激活因子，我們推測E2F7可能調控QKI的轉錄。在QKI的啟動子中，我們基于JASPR在線數據庫發現了一個E2F7的潛在結合位點(圖11F)。隨后，我們將該結合位點的野生和突變形式亞克隆到pGL3載體中。結果表明，E2F7對攜帶野生結合位點的報告載體熒光素酶活性有促進作用，但對突變位點無促進作用(圖11G)。此外，E2F7敲除降低了QKI mRNA的表達水平(圖11H)。我們檢索GEPIA數據庫，在182個食管癌組織中檢測這些關鍵分子的表達相關性，結果顯示E2F7與QKI、E2F7與TNPO1、QKI與TNPO1表達正相關(圖11I)。

結論：我們創新性地證明了circBCAR3在食管癌中的致癌作用。在分子水平上，剪接因子QKI促進circBCAR3的生物發生，通過與miR-27a-3p結合上調TNPO1，加速食管癌的發生。這些數據表明，circBCAR3可作為食管癌研究和治療的潛在標志物。

參考文獻：Xi Y, Shen Y, Wu D, Zhang J, Lin C, Wang L, Yu C, Yu B, Shen W. CircBCAR3 accelerates esophageal cancer tumorigenesis and metastasis via sponging miR-27a-3p. Mol Cancer. 2022 Jul 15;21(1):145. doi: 10.1186/s12943-022-01615-8.