蛋白質(zhì)激酶作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中心節(jié)點(diǎn)，在時(shí)間和空間上能使下游底物發(fā)生磷酸化，以催化傳遞來(lái)自細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)變化的信號(hào)。3-磷酸肌醇依賴(lài)蛋白激酶1 (PDK1)作為一種主激酶，在磷酸化和激活蛋白激酶A、B和C (AGC)家族激酶(包括AKT)中起著重要作用，但目前對(duì)PDK1的上游調(diào)控作用少有報(bào)道。本研究報(bào)道了核糖體蛋白S6激酶β1 (S6K1)直接磷酸化蛋白同源結(jié)構(gòu)域，并破壞PDK1與AKT的相互作用和活化。本文于2022年3月發(fā)表于 《Nature Communications》，IF=14.919。

本文技術(shù)路線(xiàn)：

本文主要內(nèi)容：

1 S6K1直接磷酸化PDK1的Ser549位點(diǎn)

作者推測(cè)上游激酶可能介導(dǎo)PDK1-S549磷酸化，于是分析S549周?chē)被崆闆r，發(fā)現(xiàn)S549位點(diǎn)內(nèi)存在一個(gè)經(jīng)典的AGC激酶磷酸化共識(shí)基序位點(diǎn)(RxRxxS/T) (Fig 1a)。為了評(píng)估AGC激酶家族是否可以促進(jìn)PDK1在該位點(diǎn)的磷酸化，篩選了一組AGC激酶，包括AKT1 (myr-AKT1)，AKT2 (myr-AKT2)，S6K1 (S6K1- r3a)和SGK1 (SGK1-Δ60)。用內(nèi)源性的AKT底物磷酸化抗體檢測(cè)到S6K1，而不是其他的AGC激酶在內(nèi)源性水平上顯著增強(qiáng)PDK1磷酸化(Fig 1b)。胰島素誘導(dǎo)的PDK1磷酸化可被mTORC1或S6K抑制劑顯著拮抗，AKT抑制劑的拮抗程度較低，同時(shí)S6K下游底物核糖體蛋白S6的磷酸化事件減少(Fig 1c)。與此一致的是，S6K1可以顯著增強(qiáng)PDK1的磷酸化，且呈劑量依賴(lài)性(Fig 1d)，而S6K1誘導(dǎo)的PDK1磷酸化可被mTORC1或S6K抑制劑減弱 (Fig 1e)。進(jìn)一步觀(guān)察發(fā)現(xiàn)PDK1磷酸化隨胰島素刺激而波動(dòng)。此外，胰島素在S6K1和S6K2雙敲除(S6K1 /2?/?)小鼠胚胎的成纖維細(xì)胞(mef)中極大促進(jìn)了PDK1磷酸化(Fig 1f)。提示S6K1在胰島素誘導(dǎo)中可能是必需的基因磷酸化。與這一發(fā)現(xiàn)一致的是，癌細(xì)胞中S6K1的缺失顯著減少了PDK1的磷酸化 (Fig 1g)。

為了驗(yàn)證S549是否確實(shí)是PDK1上主要的S6K1磷酸化殘基，作者發(fā)現(xiàn)S549A敲除降低了S6K1介導(dǎo)的PDK1磷酸化 (Fig 1h)。與這一發(fā)現(xiàn)一致的是，在體外S6K1可以直接磷酸化WT突變體，而不能磷酸化S549A突變體 (Fig 1i)。為了進(jìn)一步檢測(cè)S549位點(diǎn)的PDK1磷酸化，作者構(gòu)建并驗(yàn)證了磷酸化抗體特異性識(shí)別的PDK1-pS549，并觀(guān)察到S6K1確實(shí)可以在細(xì)胞的S549位點(diǎn)磷酸化PDK1 (Fig 1b-h)，也能被mTORC1或S6K抑制劑可以抑制 (Fig 1c)。這些結(jié)果表明S6K1能直接磷酸化PDK1的Ser549殘基。

Fig1  S6K直接使PDK1在Ser549位點(diǎn)磷酸化

2 S6K1介導(dǎo)的PDK1磷酸化抑制AKT激酶活性和致癌功能

為了探究S6K1介導(dǎo)的PDK1磷酸化的生物學(xué)功能，作者將PDK1的不同突變形式(WT、S549A和S549D)引入DLD1-PDK1^?/?細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)與WT或PDK1-S549D相比、PDK1-S549A表達(dá)顯著升高AKT-pT308 (Fig 2a)。此外，在胰島素處理?xiàng)l件下，如pGSK3β，與表達(dá)PDK1-WT-或S549D的細(xì)胞相比，DLD1-PDK1?/?表達(dá)PDK1-S549A的細(xì)胞中pT308-AKT及其下游底物顯著升高(Fig 2b，c)。

作者發(fā)現(xiàn)，與WT或S549D突變體PDK1相比，引入缺磷型PDK1 (S549A)可以顯著促進(jìn)細(xì)胞集落形成和錨定獨(dú)立生長(zhǎng) (Fig 2d，e)。為了揭示PDK1-S549磷酸化在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用，作者利用異種移植小鼠模型，發(fā)現(xiàn)與表達(dá)細(xì)胞S549的DLD1-PDK1?/?的細(xì)胞相比，PDK1-S549A的表達(dá)明顯促進(jìn)DLD1-PDK1?/?細(xì)胞腫瘤的生長(zhǎng) (Fig 2f–j)。同時(shí)，與PDK1-WT或S549D的表達(dá)的腫瘤相比較，攜帶PDK1-S549A的腫瘤表現(xiàn)出更多的Ki67染色，同時(shí)AKT下游底物pS6增加 (Fig 2k，l）。這些結(jié)果表明，在體內(nèi)和體外，S6K介導(dǎo)的PDK1磷酸化負(fù)調(diào)控AKT激酶活性和致癌功能。

Fig2 PDK1的磷酸化抑制AKT激酶的活性和致癌功能

3 PDK1- S549磷酸化顯著減弱PDK1與PIP3的相互作用和質(zhì)膜定位

為了研究S6K1介導(dǎo)的PDK1磷酸化是否影響其激酶活性，作者對(duì)PDK1進(jìn)行了體外激酶測(cè)定。結(jié)果表明，S6K1-R3A的組成活性形式與PDK1- wt、S549A或S549D變體僅輕度影響PDK1磷酸化其底物AKT1的能力 (Fig 3a)，表明S6K1介導(dǎo)的PDK1磷酸化對(duì)AKT激酶活性的抑制可能不是由于PDK1酶活性降低所致。接下來(lái)，作者發(fā)現(xiàn)PDK1和S6K1-R3A可顯著降低PDK1與AKT的相互作用，且呈劑量依賴(lài)性，且S549處PDK1的磷酸化水平增加 (Fig 3b)。通過(guò)磷酸化IRS1/2來(lái)排除S6K已建立的負(fù)反饋?zhàn)饔玫挠绊懀^(guān)察PDK1-S549D或S549A與AKT之間的互作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDK1-S549A的相互作用增強(qiáng)，而S549D減弱，但不影響與其他PDK1底物(如SGK1、PLK1或S6K1)的相互作用 (Fig 3c)。

已有研究表明PDK1和AKT的相互作用主要發(fā)生在PIP3定位的質(zhì)膜上，PIP3的pull-down檢測(cè)結(jié)果顯示，S6K1-R3A顯著降低了WT的相互作用，而PDK1的S549A突變體與PIP3的相互作用沒(méi)有降低(Fig 3d)。同時(shí)，抑制S6K1活性可以促進(jìn)PDK1與PIP3的相互作用(Fig 3e)。這些數(shù)據(jù)表明，S549磷酸化可以使PDK1從質(zhì)膜和PIP3中分離出來(lái)，從而降低PDK1與AKT的相互作用。與這一發(fā)現(xiàn)一致，作者觀(guān)察到S6K1確實(shí)可以通過(guò)細(xì)胞分餾分析降低PDK1的膜定位或免疫染色 (Fig 3g)。因此，與WT或S549D形式的PDK1相比，S549A突變體增強(qiáng)了PDK1膜定位。

Fig 3 S6K1介導(dǎo)的PDK1磷酸化抑制PDK1膜定位和PIP3結(jié)合

4、14-3-3介導(dǎo)PDK1從PIP3中分離，并促進(jìn)其二聚

為了揭示磷酸化PDK1與PIP3解離并形成二聚體的潛在機(jī)制，作者假設(shè)存在能夠識(shí)別磷酸化PDK1的接頭蛋白，并進(jìn)一步干擾其與PIP3的相互作用。已有研究證實(shí)14-3-3接頭蛋白在蛋白室轉(zhuǎn)位中起主要作用，尤其是磷酸化蛋白。因此，作者對(duì)14-3-3家族成員進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)14-3-3γ可以在外源和內(nèi)源水平上特異性地與PDK1相互作用 (Fig 4a–c)。值得注意的是，RxxpSxP這個(gè)基序與S6K1介導(dǎo)的PDK1磷酸化殘基(Ser549)重疊，并且在不同物種之間進(jìn)化保守 (Fig 4d)。有趣的是，與PDK1、AKT1、PLK1和SIN1衍生的不同PH結(jié)構(gòu)域相比，作者觀(guān)察到只有PDK1-PH參與14-3-3γ的結(jié)合。更重要的是，S6K1- r3a顯著增強(qiáng)，而S6K1的消耗減少了PDK1與14-3-3γ之間的互作 (Fig 4g)。在細(xì)胞和體外實(shí)驗(yàn)中，S549D突變體PDK1增強(qiáng)，而S549A突變體PDK1減弱PDK1與14-3-3γ的相互作用 (Fig 4e,f)。

先前有報(bào)道稱(chēng)，磷酸化絲氨酸或蘇氨酸后的脯氨酸殘基對(duì)14-3-3相互作用至關(guān)重要。因此，無(wú)論在細(xì)胞內(nèi)還是體外，PDK1- p551a突變均能強(qiáng)烈減弱PDK1與14-3-3γ的相互作用。然而，P551A突變體并沒(méi)有消除S6K介導(dǎo)的PDK1與PIP3的分離 (Fig 4g)，從而增加了AKT的相互作用，這不能被異位表達(dá)S6K1-R3A破壞(Fig 4g)。 S6K1-R3A或PDK1- S549d的異位表達(dá)同樣增強(qiáng)了14-3-3γ向PDK1的招募(Fig 4g)。此外，P551A突變體增強(qiáng)了其與PIP3的結(jié)合，S6K1-R3A的表達(dá)不會(huì)干擾PIP3的結(jié)合(Fig 4i)。

通過(guò)凝膠過(guò)濾的方法，作者觀(guān)察到PDK1和pS549-PDK1在其二聚體大小在150KD左右時(shí)，與14-3-3γ共聚在相似的部分(Fig 4j)，表明14-3-3γ可能是磷酸化PDK1進(jìn)行二聚反應(yīng)。此外，消耗14-3-3γ會(huì)破壞PDK1的二聚反應(yīng)(Fig 4k)，并增加PDK1與AKT的相互作用。更重要的是，14-3-3γ敲除顯著提高了AKT及其下游靶點(diǎn)磷酸化水平(Fig 4l,m)。表明接頭蛋白14-3-3γ在S6K1介導(dǎo)的AKT被PDK1抑制過(guò)程中起重要作用。這些研究結(jié)果表明，14-3-3γ以S6K1介導(dǎo)的S549磷酸化依賴(lài)的方式與PDK1結(jié)合，使PDK1與PIP3分離，進(jìn)而促進(jìn)PDK1二聚化，從而抑制AKT激酶活性(Fig 4n)。

Fig4 14-3-3γ結(jié)合磷酸化的PDK1并將其從細(xì)胞質(zhì)膜上解離

5．患者相關(guān)的PDK1突變削弱其與14-3-3的相互作用，促進(jìn)AKT激酶活性和致癌功能

為探討S6K1介導(dǎo)PDK1磷酸化在腫瘤發(fā)生中的病理作用，對(duì)癌癥基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者相關(guān)的PDK1突變發(fā)生在S6K1介導(dǎo)的PDK1磷酸化或14-3-3γ結(jié)合區(qū)域附近 (Fig 5a)。

接下來(lái)，這些突變被分成兩組，I型突變位于可能阻斷S6K1介導(dǎo)的磷酸化的區(qū)域; (R544K， R546P和S549N)；II型突變(P551A， P551L和P551Q)可能在直接干擾對(duì)14-3-3γ的識(shí)別(Fig 5a)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， I型突變以及程度較輕II型突變，顯著降低了S6K1介導(dǎo)的PDK1磷酸化(Fig 5b）。I型和II突變體顯著減弱PDK1/14-3-3γ相互作用(Fig 5c），從而增加了PDK1與PIP3的結(jié)合 (Fig 5d），以及它們的膜定位(Fig 5e–h)。值得注意的是，這些突變?cè)鰪?qiáng)了PDK1與AKT的相互作用(Fig 5i,j)，同時(shí)增加了HEK293-sgPDK1細(xì)胞中AKT及其靶蛋白的磷酸化水平 (Fig 5k,l)。

Fig5 患者相關(guān)的PDK1突變與PDK1膜位置和AKT激酶激活有關(guān)

此外，將這些變量重新引入DLD1-PDK1^?/?或SW480-shP DK1細(xì)胞中增加了pT308-AKT的表達(dá) (Fig 6a)，并促進(jìn)了癌細(xì)胞的致癌能力(Fig 6b,c)。此外，與表達(dá)WT-PDK1的細(xì)胞相比，這些突變體還促進(jìn)了異種移植小鼠模型中腫瘤的生長(zhǎng)，并增加了AKT下游的pS6，以及增殖標(biāo)志物Ki67的表達(dá)（Fig 6d–g）。

Fig 6患者來(lái)源的PDK1突變促進(jìn)AKT1的激活和致癌功能

總之，S6K1直接磷酸化PDK1的PH結(jié)構(gòu)域，增強(qiáng)PDK1結(jié)合14-3-3的能力，進(jìn)而解離PIP3和質(zhì)膜中的PDK1，導(dǎo)致PDK1/AKT相互作用減少，AKTT308磷酸化受損。這一觀(guān)察結(jié)果表明，S6K1以不同的負(fù)反饋方式和磷酸化依賴(lài)方式緊密控制AKT激酶的活性（Fig 7）。

Fig 7 生理和病理?xiàng)l件下S6K1對(duì)PDK1負(fù)調(diào)控的模型

參考文獻(xiàn)：

Jiang, Q., et al., S6K1-mediated phosphorylation of PDK1 impairs AKT kinase activity and oncogenic functions. Nat Commun, 2022. 13(1): p. 1548.