雖然表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)在肺腺癌(LUAD)患者中顯示有效，但TKI耐藥性不可避免地發(fā)展，限制了長期結(jié)果。因此，迫切需要解決LUAD的耐藥性問題。lncRNA HIF1A-AS2可能是各種類型腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵介導(dǎo)因子。我們研究了HIF1A-AS2在改善肺腺癌腫瘤加重和奧希替尼耐藥中的作用。在臨床樣本中，我們發(fā)現(xiàn)HIF1A-AS2在LUAD樣本中上調(diào)，預(yù)示著較差的總生存期和無病生存期。HIF1A-AS2沉默抑制LUAD細(xì)胞的增殖、遷移和腫瘤發(fā)生，以及奧西替尼對體外和體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的治療效果。HIF1A-AS2海綿吸收miR-146b-5p，促進(jìn)IL-6表達(dá)，激活IL-6/STAT3通路，導(dǎo)致LUAD進(jìn)展。miR-146b-5p和IL-6水平與LUAD患者的預(yù)后相關(guān)。我們的結(jié)果表明，HIF1A-AS2通過靶向miR-146b5p/IL-6/STAT3軸在腺癌細(xì)胞中發(fā)揮致癌因子的作用，并可能是生存的預(yù)后指標(biāo)。此外，它可以成為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，以提高奧西替尼在LUAD患者中的療效。本文于2021年9月發(fā)表在“Molecular Therapy-Nucleic Acids”（IF: 8.886）期刊上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）HIF1A-AS2在LUAD組織中上調(diào)，與預(yù)后不良相關(guān)

為了研究HIF1A-AS2在LUAD中的作用，我們利用qRT-PCR檢測了HIF1A-AS2在56個(gè)LUAD組織和匹配的正常瘤周組織中的相對表達(dá)。如圖1A所示，HIF1A-AS2在LUAD組織中表達(dá)顯著上調(diào)。為了驗(yàn)證HIF1A-AS2在LUAD中的表達(dá)，我們研究了TCGA)-LUAD數(shù)據(jù)庫。與正常組織相比，HIF1A-AS2在腫瘤組織中的表達(dá)顯著上調(diào)(圖1B)。HIF1A-AS2高表達(dá)患者的DFS率和總生存期(OS)率顯著低于低表達(dá)患者(圖1C和1D)。在TCGA-LUAD數(shù)據(jù)庫中，HIF1AAS2水平低的患者OS顯著高于HIF1A-AS2水平高的患者(圖1E)。在接受EGFR-TKI治療的晚期LUAD患者的血液樣本中，HIF1A-AS2表達(dá)分析顯示，那些低表達(dá)HIF1A-AS2的患者對EGFR-TKI有良好的反應(yīng)，而高表達(dá)HIF1AAS2的患者則表現(xiàn)出較差的反應(yīng)(圖1F)。這些結(jié)果提示，HIF1A-AS2的表達(dá)顯著升高，與LUAD患者預(yù)后不良和奧西替尼耐藥有關(guān)。  

2）HIF1A-AS2促進(jìn)LUAD細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和對奧希替尼的耐藥性

為了探索HIF1A-AS2在LUAD中的潛在生物學(xué)功能，我們轉(zhuǎn)染了靶向HIF1A-AS2的shRNA或?qū)φ誷hRNA到PC9細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h，qRT-PCR證實(shí)轉(zhuǎn)染效率(圖2A)。HIF1A-AS2的下調(diào)降低了PC9細(xì)胞的增殖以及遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)量(圖2B-2D)。我們從親本PC9和HCC827細(xì)胞中獲得耐奧希替尼的PC9/OR和HCC827/OR細(xì)胞，其抑制濃度顯著增加(圖2 E)。HIF1A-AS2在PC9/OR和HCC827/OR細(xì)胞中的相對表達(dá)量高于親代細(xì)胞(圖2F)。因此，我們確定HIF1A-AS2是否影響了LAUD細(xì)胞對奧希替尼的敏感性。如圖2G所示，與對照組細(xì)胞相比，在HIF1A-AS2缺少的PC9/OR和HCC827/OR細(xì)胞中，奧希替尼的IC50顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明，HIF1A-AS2基因的下調(diào)抑制了LAUD細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和對奧希替尼的耐藥性。

我們進(jìn)一步通過在PC9和HCC827細(xì)胞中過表達(dá)HIF1A-AS2來研究HIF1A-AS2的功能。我們建立了穩(wěn)定過表達(dá)HIF1A-AS2的HCC287細(xì)胞(圖2H)。與對照組相比，HIF1A-AS2的過表達(dá)促進(jìn)了HCC287細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力(圖2I-2K)。此外，我們還檢測了HIF1A-AS2上調(diào)對LAUD細(xì)胞對奧希替尼敏感性的影響。如圖2L所示，HIF1A-AS2表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致奧希替尼在PC9和HCC827細(xì)胞中的IC50增加。提示HIF1A-AS2促進(jìn)LUAD細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和對奧希替尼的耐藥。 

3）HIF1A-AS2在LAUD中作為miR-146b5p/IL-6的海綿

我們進(jìn)行了RNA-seq來探索在HIF1A-AS2敲低的PC9/OR細(xì)胞中HIF1A-AS2的潛在靶結(jié)合miRNAs和mRNA。其中上調(diào)基因209個(gè)，下調(diào)基因414個(gè)(圖3A)。當(dāng)HIF1A-AS2被抑制時(shí)，包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、IL-17信號通路和EGFRTKI耐藥在內(nèi)的信號通路發(fā)生改變(圖3B)。在潛在的候選miRNAs中，miR-146b-3p、miR-146b-5p、miR-615-3p、miR-99b-5p、miR-1307-5p和miR-378d的表達(dá)水平與HIF1A-AS2呈負(fù)相關(guān)。qRT-PCR分析證實(shí)，HIF1A-AS2上調(diào)后，miR146b-3p、miR146b-5p和miR99b-5p的表達(dá)均顯著下調(diào)。相比之下，沉默HIF1A-AS2增強(qiáng)了miR146b-3p、miR146b-5p和miR99b-5p的表達(dá)(圖3C和3D)。 

4）HIF1A-AS2通過競爭miR-146b-5p促進(jìn)LAUD的惡性特性和奧希替尼耐藥性

生物信息學(xué)分析顯示HIF1A-AS2和miR146b-5p之間存在推定的互補(bǔ)序列。為了確定HIF1AAS2是否確實(shí)被miR146b-5p、野生型(HIF1AAS2- wt)和miR146b-5p結(jié)合位點(diǎn)靶向，我們合成了突變型HIF1A-AS2 (HIF1A-AS2- mut)熒光素酶報(bào)告基因(圖4A)。結(jié)果顯示，HIF1A-AS2-WT與miR146b-5p模擬物共轉(zhuǎn)染顯著降低了PC9細(xì)胞中的熒光素酶活性(圖4B)。此外，我們進(jìn)行了RIP實(shí)驗(yàn)，顯示HIF1A-AS2和miR146b-5p在LUAD細(xì)胞中優(yōu)先富集于含AGO2的小珠中，從而驗(yàn)證了HIF1A-AS2和miR-146b-5p之間的相互作用(圖4C)。為了驗(yàn)證miR146b-5p在HIF1A-AS2調(diào)控LUAD進(jìn)展中的作用，我們進(jìn)行了拯救實(shí)驗(yàn)。用miR146b-5p模擬物處理可阻斷PC9細(xì)胞中HIF1A-AS2過表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移(圖4D-4F)。相比之下，抗miR-146b -5p治療減弱了HIF1A-AS2下調(diào)對PC9/OR細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用(圖4G-4I)。此外，在HIF1A-AS2上調(diào)的PC9細(xì)胞中，奧希替尼增加的IC50可被miR146b-5p模擬物部分逆轉(zhuǎn)(圖4J)。為了研究miR-146b-5p在LUAD中的臨床相關(guān)性，我們在127例原發(fā)性LUAD組織中使用qRT-PCR檢測了miR-146b-5p的表達(dá)。HIF1A-AS2和miR-146b-5p表達(dá)之間存在負(fù)相關(guān)(圖4K)。miR-146b-5p高表達(dá)的患者比低表達(dá)的患者預(yù)后良好(圖4L和4M)。這些結(jié)果表明，HIF1A-AS2通過海綿吸附miR146b-5p起到了ceRNA的作用，可以部分克服HIF1A-AS2對LUAD細(xì)胞增殖、遷移和奧希替尼敏感性的促進(jìn)作用。

5）HIF1A-AS2通過干擾miR-146b-5p/IL-6/ STAT3軸促進(jìn)LAUD的惡性特性和奧希替尼耐藥性

生物信息學(xué)分析預(yù)測IL-6是HIF1A-AS2/miR-146b-5p軸的靶基因。使用生物信息學(xué)工具確定了miR-146b-5p與IL-6的3?UTR區(qū)域之間的潛在結(jié)合位點(diǎn)(圖5A)。熒光素酶報(bào)告基因檢測顯示IL-6-WT載體的熒光素酶活性低于IL-6-Mut載體(圖5B)。為了闡明HIF1A-AS2與IL-6之間的關(guān)系，我們采用qRT-PCR檢測HIF1A-AS2過表達(dá)或敲低表達(dá)的LAUD細(xì)胞中IL-6的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，HIF1A-AS2的上調(diào)增強(qiáng)了PC9細(xì)胞中IL-6的表達(dá)(圖5C)，而HIF1A-AS2的沉默抑制了PC9/OR細(xì)胞中IL-6的表達(dá)(圖5D)，這也通過western blotting得到驗(yàn)證 (圖5E)。我們推測HIF1A-AS2可能通過與miR146b-5p相互作用激活I(lǐng)L-6/STAT3通路。接下來，我們探討了HIF1A-AS2和STAT3通路之間的關(guān)聯(lián)。Western blotting證實(shí)過表達(dá)HIF1A-AS2的PC9細(xì)胞中p-STAT3蛋白水平升高，而HIF1A-AS2敲低的PC9/OR細(xì)胞中p-STAT3蛋白水平降低。值得注意的是，STAT3水平保持不變(圖5E)。此外，在PC9細(xì)胞中，HIF1A-AS2過表達(dá)誘導(dǎo)IL-6和p-STAT3上調(diào)被miR-146b-5p模擬物阻斷(圖5F)。一致地，shHIF1A-AS2下調(diào)IL-6和pSTAT3的表達(dá)，這在PC9/OR細(xì)胞中被miR146b-5p抑制劑基本消除(圖5G)。在HIF1A-AS2過表達(dá)的PC9細(xì)胞中，奧希替尼增加的IC50可通過下調(diào)IL-6或隱丹參酮的表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)(圖5H和5I)。接下來，我們分析了LUAD樣本中HIF1A-AS2、IL-6和miR146b-5p的表達(dá)， HIF1A-AS2與IL-6呈正相關(guān)，IL-6與miR146b-5p呈負(fù)相關(guān)(圖5J)。此外，IL-6高表達(dá)提示LUAD患者DFS和OS低(圖5K和5M)。綜上所述，HIF1A-AS2可能通過結(jié)合miR146b-5p激活I(lǐng)L-6/STAT3通路，促進(jìn)LUAD的惡性特征。

6）靶向HIF1A-AS2在體內(nèi)可抑制腫瘤生長和奧希替尼耐藥

為了探討HIF1A-AS2在體內(nèi)腫瘤發(fā)生中的作用，我們進(jìn)行了一項(xiàng)異種移植瘤實(shí)驗(yàn)。與對照組相比，上調(diào)HIF1A-AS2顯著增加腫瘤體積和重量。相比之下，沉默HIF1A-AS2可減少腫瘤體積和重量(圖6A-6C)。與對照組相比，PC9-HIF1A-AS2細(xì)胞植入小鼠獲得的腫瘤組織中HIF1A-AS2表達(dá)上調(diào)。相比之下，接種PC9/OR-shHIF1A-AS2細(xì)胞的小鼠腫瘤組織中HIF1A-AS2的表達(dá)減少(圖6D)。與對照組相比，接種PC9-HIF1A-AS2細(xì)胞的小鼠腫瘤組織中miR-146b-5p的表達(dá)水平降低。相反，在接種PC9/OR-shHIF1A-AS2細(xì)胞的小鼠腫瘤組織中，miR-146b-5p的表達(dá)增加(圖6E)。接下來，我們使用IHC方法分析腫瘤組織中Ki-67、IL-6和p-STAT3的表達(dá)。與PC9-Control小鼠相比，PC9-HIF1A-AS2小鼠腫瘤中Ki-67、IL-6和p-STAT3的表達(dá)顯著增強(qiáng)。相反，與PC9/OR-shHIF1A-AS2小鼠相比，PC9/ OR-shControl小鼠腫瘤中Ki-67、IL-6和p-STAT3的表達(dá)下降(圖6F)。接著，為了探討體內(nèi)靶向HIF1A-AS2對耐奧希替尼的LUAD細(xì)胞腫瘤生長的影響，我們設(shè)計(jì)并使用了一種靶向HIF1A-AS2的ASO作為拮抗劑來抑制內(nèi)源性HIF1A-AS2的表達(dá)。與奧希替尼加NC組相比，奧希替尼聯(lián)合ASO治療顯著抑制腫瘤生長，腫瘤生長抑制率為72.4%(圖6G和6H)。與NC組相比，奧希替尼+ ASO聯(lián)合治療也顯著降低了腫瘤重量(圖6I)。總的來說，HIF1A-AS2抑制可能是對奧希替尼耐藥的LUAD患者的一種有效的治療策略，它受miR-146b-5p/IL-6/STAT3軸的調(diào)控(圖7)。

結(jié)論：HIF1A-AS2通過海綿miR-146b-5p作為ceRNA上調(diào)IL-6的表達(dá)，激活STAT3信號通路，誘導(dǎo)奧希替尼耐藥和體內(nèi)腫瘤生長。因此，我們的結(jié)果為HIF1A-AS2是LUAD潛在的治療靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

Si J, Ma Y, Lv C, Hong Y, Tan H, Yang Y. HIF1A-AS2 induces osimertinib resistance in lung adenocarcinoma patients by regulating the miR-146b-5p/IL-6/STAT3 axis. Mol Ther Nucleic Acids. 2021 Sep 14;26:613-624. doi: 10.1016/j.omtn.2021.09.003. PMID: 34703647; PMCID: PMC8517096.