細胞死亡提供宿主防御并維持體內平衡。Z-DNA結合蛋白1 (ZBP1)激活炎癥性細胞死亡(PANoptosis)，而作用于RNA 1的腺苷脫氨酶(ADAR1)作為RNA編輯器維持體內平衡。最新研究結果表明，ADAR1抑制ZBP1介導的PANoptosis，促進腫瘤的發生。明確ADAR1和ZBP1在細胞死亡中的功能對于制定癌癥和其他疾病的治療策略至關重要。該研究發表2021年10月發表在《Cell Reports》，IF:9.423。

技術路線：

主要研究結果：

1. IFN信號轉導增強核轉運抑制劑誘導的細胞死亡

前期大量文獻證明了NEIs誘導的細胞死亡途徑對于理解NEIs抑制腫瘤發生的分子機制至關重要。為了確定NEIs是否能誘導細胞死亡，用NEIs KPT-330或LMB治療骨髓來源的巨噬細胞（BMDM）。KPT-330或LMB治療24小時后，BMDM中的細胞死亡水平較低（圖1A和1C）。而與單獨使用KPT-330或LMB治療相比，IFN-b或IFN-g聯合KPT-330或LMB治療增加了細胞死亡的發生率（圖1A- 1C），這表明IFN信號增強了NEIs誘導的細胞死亡。

另外，用NEIs處理可產生少量活性GSDMD P30片段，僅對NEIs反應時，caspase-1和caspase-11的切割量最小，與產生的GSDMD P30的數量一致（圖1D）。除了pyroptosis，還發現KPT-330或LMB誘導BMDM中凋亡效應物的激活，如凋亡的caspase-8、-3和-7的裂解（圖1E）。用KPT-330或LMB刺激的細胞顯示MLKL的低水平磷酸化（圖1F），表明壞死效應物的激活正在發生。

與細胞死亡的發生率一致，IFN-b或IFN-g治療可增強KPT-330-或LMB誘導的caspase-1和GSDME的裂解(pyroptosis)；caspase-8、-3和-7的裂解(apoptosis);和MLKL磷酸化(necroptosis)（圖1D-1F）。總的來說，這些數據表明，IFN與NEIs聯合使用可使細胞發生炎性小體激活和細胞死亡，包括焦亡、凋亡和壞死，表明PANoptosis正在發生。

圖1. 干擾素增強核輸出抑制劑誘導的細胞死亡

2.   ZBP1參與RIPK3信號通路激活NLRP3炎癥小體和NEIs誘導的PANoptosis

在IFN-b和NEI治療后，與野生型（WT）BMDM相比，缺乏ZBP1的BMDM減少了細胞死亡（圖2A、2C）。與這種保護作用相一致，Zbp1^–/– BMDMs顯示pyroptotic, apoptotic, 和 necroptotic分子的激活減少（圖2D-2F），表明Zbp1是IFN-和NEI誘導的NLRP3炎癥小體激活和PANoptosis所必需的。此外，使用IFN-b和KPT-330或IFN-b和LMB治療后，結果與IFN-b和NEI治療后一致。

圖2. ZBP1在IFN和核出口抑制劑的聯合作用下觸發炎癥小體激活和細胞死亡

3.       ADAR1抑制ZBP1介導的NLRP3炎癥小體激活和PANoptosis

從髓系細胞中缺乏ADAR1的小鼠(ADAR1 / BMDMs)中獲得BMDMs，以研究ADAR1在NEI介導的炎癥小體激活和PANoptosis中的作用。與WT和Zbp1^–/–細胞相比，缺乏ADAR1的細胞中IFN-b和KPT-330或IFN-b和LMB聯合誘導的細胞死亡增加（圖3A和3B）。此外，與WT和Zbp1^–/–BMDM相比，缺乏ADAR1的BMDM加速了細胞死亡（圖3A）。盡管ADAR1-p150和ZBP1都是IFN可誘導且包含Za結構域，這些分子在細胞死亡方面表現出不同的表型：ZBP1的丟失抑制細胞死亡，ADAR1的丟失促進細胞死亡(圖2、3A和3B)。

單獨使用KRT -330或LMB治療后，Adar1 / BMDMs細胞死亡增加（圖3C和3D）。Adar1^–/– BMDMs增加了caspase-1的裂解和pyroptotic分子GSDME的活化；apoptotic的caspase；以及單獨使用KRT -330或LMB處理后的壞死分子MLKL（圖3E-3G），提示ADAR1抑制NEIs誘導的NLRP3炎癥小體激活和PANoptosis。同時缺乏ADAR1和ZBP1的BMDMs在KPT-330或LMB作用下的細胞死亡與WT細胞相似（圖4A和4B）。此外，NEIs處理的Adar1^–/– BMDMs中，ZBP1的缺失抑制了NLRP3炎癥小體的激活以及焦亡、凋亡和壞死效應物的激活（圖4C-4E）。

圖3. ADAR1缺陷導致核輸出抑制劑導致細胞加速死亡

圖4. 缺失ZBP1拯救ADAR1缺陷細胞中核輸出抑制劑誘導的炎癥體激活和細胞死亡

4.       IFNs促進NEIs產生EREs并激活ZBP1

經KPT-330或LMB處理后，Adar1^–/– BMDMs中的dsRNA數量增加（圖5A和5B）。為了測試KPT-330或LMB處理是否能誘導ERE衍生的dsRNA，結果顯示用KPT-330或LMB處理Adar1^–/– BMDM可增加ERE的表達（圖5C）。與培養基處理的WT細胞相比，單獨使用KPT-330或LMB處理的WT細胞增加了dsRNA水平（圖5D）。然而，與PBS、KPT-330或LMB處理的WT細胞相比，IFN-b和KPT-330或IFN-b和LMB的組合更有力地增加了dsRNA（圖5D和5E）。此外，單獨使用KPT-330或LMB治療的細胞中，ERE的表達上調，在聯合使用IFN-b和KPT-330或IFN-b和LMB治療的細胞中更顯著地增加（圖5F）。

圖5. IFN信號通過核出口抑制劑增強雙鏈RNA (dsRNA)的積累

5.       ADAR1與RIPK3競爭ZBP1結合抑制炎癥小體激活和細胞死亡

在IFN-b刺激下，ADAR1和ZBP1的表達上調（圖6A）。此外，LMB治療能夠誘導ADAR1和ZBP1的表達，但不如IFN-b刺激那么強烈（圖6A）。在基礎條件下未觀察到ZBP1和ADAR1之間的相互作用（圖6B）。然而，在IFN-b刺激的WT細胞中，觀察到ZBP1與ADAR1的強烈相互作用，而不是與RIPK3的強烈相互作用（圖6B）。雖然單獨使用KPT-330或LMB處理的WT細胞顯示出ZBP1與ADAR1和RIPK3都有一定的相互作用，但IFN-b與KPT-330或LMB聯合刺激則減少了ZBP1與ADAR1的相互作用，增加了ZBP1與RIPK3的相互作用（圖6B）。

WT ZBP1與ADAR1共免疫沉淀顯示ZBP1與RHIM或C末端結構域相互作用（圖6C）。在WT BMDM中未檢測到ADAR1和ZBP1或RIPK3和ZBP1之間的任何相互作用（圖6D）。經IFN-b和KPT-330或IFN-b和LMB治療后，ZBP1與WT BMDM中的ADAR1和RIPK3相互作用（圖6B和6D）。然而，在缺乏ADAR1的情況下，ZBP1和RIPK3之間的相互作用增加（圖6D和S6D）。此外，與WT細胞相比，Ripk3^–/–細胞中ZBP1和ADAR1之間的相互作用增加（圖6D），表明ADAR1與Ripk3競爭結合ZBP1。此外，在缺乏其Za2結構域的情況下，在經IFN-b和KPT-330治療的BMDM中，ZBP1沒有與RIPK3相互作用（圖S6E），這表明ZBP1的Za2結構域是促進ZBP1和RIPK3的RHIM結構域之間相互作用所必需的。在BMDMs中沉默PKR，并使用IFN-b與KPT-330或LMB聯合治療，觀察到細胞死亡沒有差異(圖S6F)，表明這是一個PKR獨立的機制。

圖6. ADAR1與RIPK3競爭與ZBP1的結合

6.       ADAR1通過抑制ZBP1介導的炎癥細胞死亡促進腫瘤發生

與同窩對照小鼠相比，Adar1^fl/flLysM^cre小鼠結腸的腫瘤負擔在腫瘤數量和腫瘤大小方面都較低（圖7A-7C）。Adar1^fl/flLysM^creZbp1^–/–小鼠顯示出與對照小鼠相似的腫瘤負擔（圖7D 7F）。此外，ZBP1 Za2結構域的缺失產生了類似的結果（圖7D-7F），表明ZBP1 Za2結構域在抑制骨髓細胞中缺乏ADAR1的小鼠的結直腸腫瘤發生中至關重要。

關于IFN和NEIs治療黑色素瘤的療效方面。B16黑色素瘤細胞植入后8天用KPT-330治療的WT小鼠顯示黑色素瘤生長減少（圖7G和7H）。此外，IFN-g和KPT-330聯合治療的小鼠腫瘤消退顯著改善（圖7G和7H）。為了確定腫瘤消退是否依賴于ZBP1，將IFN-g和KPT-330聯合應用于WT和ZBP1/小鼠。IFN-g和KPT-330未能使Zbp1^–/–小鼠中的黑色素瘤消退（圖7I）。ZBP1的Za2結構域的缺失產生了類似的結果（圖7I），表明ZBP1，尤其是其Za2結構域，對于抑制IFN和NEIs聯合治療的腫瘤發生至關重要。

圖7. ADAR1-ZBP1相互作用的調節影響腫瘤的發生

主要結論：

這項研究結果表明ADAR1通過抑制ZBP1介導的炎癥細胞死亡和PANoptosis，作為一個限制抗腫瘤免疫的檢查點，并提示影響ADAR1-ZBP1相互作用的策略，如使用IFN和NEIs治療可能是有前景的。這些結果提供了更深入的理解細胞死亡的細胞和分子機制，特別是PANoptosis，并將為發展有效的治療策略對抗癌癥提供重要的信息。

參考文獻：

Karki R, Sundaram B, Sharma BR, Lee S, Malireddi RKS, Nguyen LN, Christgen S, Zheng M, Wang Y, Samir P, Neale G, Vogel P, Kanneganti TD. ADAR1 restricts ZBP1-mediated immune response and PANoptosis to promote tumorigenesis. Cell Rep. 2021; 37(3):109858. doi: 10.1016/j.celrep.2021.109858. PMID: 34686350.