選擇性雌激素受體調節劑(SERMs)如他莫昔芬已被證明對雌激素受體(ER)陽性乳腺癌有效。然而，這種內分泌治療的主要障礙是雌激素獨立生長，導致耐藥性，其潛在機制尚不完全清楚。目前，有研究對長鏈非編碼RNA (lncRNA)是否參與ER陽性乳腺癌中雌激素獨立生長和他莫西芬耐藥的調控進行了研究，該研究于2021年10月發表在《Cell Death & Disease》，IF:8.469。

主要技術路線：

主要研究結果：

1. Lnc-DC被鑒定為參與雌激素獨立生長的潛在lncRNA；它的上調與乳腺癌患者的生存和他莫西芬反應有關。

作者首先對參與雌激素非依賴性生長的lncRNA進行功能篩選。使用圖中概述的選擇程序圖1A，發現在雌激素剝奪28天后，用于載體控制的存活細胞很少，而用于SAM gRNA文庫的存活細胞更多，這表明可以促進細胞在無E2培養基中存活的SAM gRNA被富集。由于雌激素非依賴性常常導致三苯氧胺抵抗，因此這個過程是否會影響這些細胞對三苯氧胺的反應。正如所料，選擇后(As)細胞比選擇前(BS)細胞對他莫昔芬更具耐藥性(圖1B)。與這些結果一致的是，TUNEL檢測顯示，AS細胞在三苯氧胺作用下的凋亡率(~8%)遠低于BS細胞(~20%)(圖1C)。接下來，將BS細胞或AS細胞注射到雌性裸鼠的乳腺脂肪墊中，以確定它們是否可以在不補充雌激素的情況下生長成腫瘤。正如預期的那樣，添加E2(雌二醇顆粒)的親代MCF-7導致100%的腫瘤發生率(圖1D)。不含E2的BS細胞腫瘤率為17%；相比之下，不含E2的AS細胞腫瘤攝取率為35%(圖1D)，進一步表明lncRNA參與促進雌激素獨立生長。為了確定哪些SAM gRNAs被這種選擇富集，作者采用了兩步方法。第一步是對該文庫中的每個lncRNA進行qRT-PCR序列分析。第二步是利用gRNA特異性引物集，通過qRT-PCR檢測SAM gRNA的相對豐度，重點檢測雌激素剝奪后富集的SAM gRNA。lncRNA分析發現，與選擇前(BS)相比，選擇后(AS)有3個lncRNA (C1qTNF9B-AS1, Lnc-DC和MEG3)表達上調(圖1E)。基于乳腺癌基因芯片數據庫，發現Lnc-DC和MEG3都在數據庫中。有趣的是，在1764例乳腺癌病例中，Lnc-DC上調與無復發生存期(RFS)較差相關，Logrank為4.6e-0.5, HR = 1.39(圖1F)。高Lnc-DC水平與低RFS相關，Logrank為0.01,HR = 4.4(圖1G)。該分析也支持了Lnc-DC水平高的患者對他莫昔芬反應較差的觀點(圖1H)，提示了Lnc-DC的臨床重要性。因此，我們進一步對Lnc-DC進行了表征，用于后續實驗。

圖1 Lnc-DC作為一種潛在的lncRNA參與雌激素獨立和他莫西芬耐藥。

2. Lnc-DC促進他莫昔芬耐藥

為了證實Lnc-DC gRNA對上調Lnc-DC表達的作用，從gRNA區域和支架區域設計了引物來檢測外源性的Lnc-DC gRNA水平。雖然該SAM文庫中包含5種不同的Lnc-DC gRNA，但選擇后只有Lnc-DC gRNA 1 (Lnc-DC1)高度富集(圖2A)。另外，只有LncDC1能夠激活內源性的Lnc-DC表達(圖2B)，這表明雖然不是所有的gRNA都能誘導內源性基因表達，但那些能夠誘導內源性基因表達的gRNA可以通過雌激素剝奪等選擇手段富集。接下來，作者確定了Lnc-DC對他莫昔芬耐藥的貢獻。用它莫西芬處理Lnc-DC1細胞和載體對照細胞。如圖2C所示，Lnc-DC1細胞對他莫昔芬的抗性是載體對照細胞的3倍。同樣，Lnc-DC1導致的凋亡率低于載體對照(圖2D)。此外，Lnc-DC1細胞顯示Bcl2和Bcl-xL水平升高(圖2E)，這可能是觀察到的對他莫昔芬耐藥的部分原因。Lnc-DC也降低了PARP和Caspase 3的裂解水平(圖2F)。通過TUNEL實驗可以明顯看出，Lnc-DC KO細胞對他莫昔芬更敏感(圖3A)。然后，作者選擇了兩個單一的Lnc-DC KO克隆，同時納入了另一個ER陽性乳腺癌細胞系T47D(圖S4)。菌落形成分析顯示，在MCF-7細胞中，兩個Lnc-DC KO克隆對他莫昔芬更敏感(圖3B)。例如，MCF-7 Lnc-DC KO的IC50為11.6 (KO#17)和12.92 (KO#66)，而病媒控制(IC50為21.3)。與載體對照相比，Lnc-DC KO T47D細胞對他莫昔芬也更敏感(圖3C)。為了進一步確定Lnc-DC在他莫昔芬耐藥中的作用，作者進行了搶救實驗。在MCF-7和T47D細胞中，發現Lnc-DC KO增加了對他莫昔芬的敏感性；相比之下，在KO細胞中Lnc-DC的重新表達恢復了作為載體對照的他莫昔芬應答(圖3D, E)。總之，這些結果支持了LncDC在他莫昔芬耐藥中的作用。

圖2 Lnc-DC促進他莫昔芬耐藥

圖3用Lnc-DC KO法和搶救法測定Lnc-DC介導的他莫昔芬耐藥性。

3. Lnc-DC促進STAT3磷酸化

為了確定Lnc-DC如何促進他莫昔芬耐藥，作者檢測了這些細胞中STAT3的磷酸化。首先在選擇前檢測了攜帶SAM gRNA庫的細胞中STAT3的磷酸化，發現載體細胞和庫細胞之間沒有差異(圖4A)。然而，在選擇后，庫細胞比BS細胞顯示更高水平的磷酸化STAT3(圖4B)。為了確定Lnc-DC在STAT3激活中的作用，作者過表達了Lnc-DC，發現LncDC1能夠增加pSTAT3^Y705在正常和E2游離培養基中的水平(圖4C)。此外，Lnc-DC KO導致pSTAT3^Y705水平下降(圖4D)。STAT3抗體RNA免疫沉淀實驗證實Lnc-DC與STAT3相互作用(圖4E)。此外，在S1m-LNC-DC沉淀中檢測到一個STAT3帶。這些結果有力地支持了Lnc-DC和STAT3之間的相互作用是特定的。為了確定Lnc-DC如何影響STAT3活性，作者發現雌激素剝奪降低了STAT3與SHP-1的相互作用(圖4G)， 而SHP-1是一種參與調控STAT3活性的磷酸酶。重要的是，Lnc-DC降低了SHP-1與STAT3之間的相互作用(圖4H)，這可能部分解釋了當Lnc-DC水平升高時，STAT3活性升高的原因。

圖4 Lnc-DC通過與STAT3相互作用促進STAT3活性

4. 他莫昔芬耐藥AS細胞分泌的細胞因子激活STAT3

與載體對照相比，在AS細胞的條件培養基中觀察到pSTAT3^Y705的明顯激活(圖5A)，表明細胞因子分泌到培養基中，能夠激活相鄰細胞的STAT3。為了確定從AS細胞培養中分泌的細胞因子，通過攜帶102種細胞因子抗體的細胞因子陣列從條件培養基中進行細胞因子分析。事實上，有一組11種細胞因子在AS細胞來源的培養基中比在載體對照細胞中更高(圖5B)。qRT-PCR分析驗證了其中5個(GDF15、IGFBP-2 PDFG-A、CXCL12和VEGF)(圖5C為綠色)，與載體對照相比，它們在AS細胞中也上調(圖5D)。qRT-PCR分析顯示，這5個細胞因子基因中有4個在STAT3 KD細胞中明顯下調(圖5E)。特別是GDF15的抑制最為明顯。最后，與對照組相比，用GDF15、IGFBP-2和VEGF處理MCF-7細胞可增強pSTAT3^Y705的磷酸化(圖5F)。這些結果提示STAT3和細胞因子存在一個正反饋回路，它們共同促進他莫昔芬耐藥。

圖5 STAT3介導的細胞因子的產生

5. Lnc-DC通過STAT3促進細胞因子的產生

通過qRT-PCR證實了Lnc-DC1細胞中三個細胞因子基因中的兩個被轉錄激活(圖6A)。還發現這兩種細胞因子的蛋白質水平升高(圖6B)。此外，在Lnc-DC細胞中通過siRNA下調STAT3，發現STAT3 KD能夠抑制GDF15和IGFBP2(圖6C)。此外，Lnc-DC KO下調GDF15 mRNA水平(圖6D)和蛋白水平(圖6E)。特別是， GDF15在GDF15轉錄起始位點上游約600 bp處攜帶一個典型的STAT3結合位點(圖6F)。STAT3抗體ChIP分析證實STAT3與GDF15啟動子相互作用(圖6F)。針對GDF15啟動子的PCR引物僅在STAT3抗體通道中檢測到一條獨特的PCR帶，而IgG或Ku80抗體(陰性對照)通道中檢測不到。總之，這些結果表明，在Lnc-DC起關鍵作用的地方存在STAT3-細胞因子循環。結果，這些細胞變得獨立于雌激素，并對它莫西芬產生抗藥性(圖6G)。

圖6 Lnc-DC促進細胞因子基因的表達

主要結論：

綜上所述，作者證明了Lnc-DC在STAT3細胞因子環路的調控中發揮了關鍵作用，導致雌激素獨立和他莫西芬耐藥。此外，臨床數據挖掘表明，Lnc-DC可能作為預測他莫昔芬反應的潛在標志物。在這個調節系統中，JAK促進STAT3磷酸化，而SHP-1促進去磷酸化。Lnc-DC與STAT3的相互作用可能阻止SHP-1對pSTAT3的作用，保持較高的pSTAT3水平。STAT3已知能夠上調抗凋亡基因，并刺激細胞因子的產生。由于CXCL12、IGFBP2和GDF15等細胞因子可同時受ER和STAT3調控，可以想象這些細胞因子除了抗凋亡基因外，可以在升高的Lnc-DC背景下持續產生，即使通過雌激素剝奪或三苯氧胺治療等臨床干預手段關閉內質網信號，這些腫瘤細胞仍能存活和生長。該研究為臨床研究他莫昔芬耐藥提供新的思路。