CD8+T細(xì)胞是最重要的癌癥適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，通過(guò)直接殺死癌細(xì)胞來(lái)介導(dǎo)抗腫瘤免疫。PD-1抑制激活CD8 + T細(xì)胞以增加T細(xì)胞免疫力，從而導(dǎo)致癌癥消退。因此，CD8 + T細(xì)胞的激活可能是通過(guò)免疫療法治療LSCC的關(guān)鍵。

這篇文章以生信分析開(kāi)篇，篩選出關(guān)鍵基因后在動(dòng)物模型與臨床樣本中進(jìn)行了簡(jiǎn)單的驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)思路如下：

1.  下載GEO數(shù)據(jù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)篩選

下載數(shù)據(jù)集GSE17710，選擇變異系數(shù)＞0.1的5000個(gè)基因進(jìn)行后續(xù)WGCNA分析

2.  CIBERSORT分析免疫浸潤(rùn)

分析獲得每個(gè)樣本中22種免疫細(xì)胞的豐度，選擇T細(xì)胞作為WGCNA分析的性狀集合（其中，T細(xì)胞包括7中亞型）

3.  WGCNA構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)

使用R包“ WGCNA”對(duì)5000個(gè)WGCNA分析，構(gòu)建LSCC基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，軟閾值β= 5（R2 = 0.9）構(gòu)建無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)。動(dòng)態(tài)混合切割來(lái)建立分層聚類樹(shù)，樹(shù)枝代表了一系列具有相似表達(dá)數(shù)據(jù)的基因，每個(gè)樹(shù)葉代表了樹(shù)上的單個(gè)基因。生成了十八個(gè)模塊。

4.  篩選關(guān)鍵模塊（hub module）并進(jìn)行富集分析

分析發(fā)現(xiàn)，棕色模塊與CD8+T細(xì)胞顯著相關(guān)（R 2 = -0.05，P = 9e-05），因此選擇棕色模塊為hub module進(jìn)行富集分析。

5.  在hub module中篩選出關(guān)鍵基因（hub gene）并驗(yàn)證

為了研究與樞紐模塊中CD8 + T細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)的潛在樞紐基因，構(gòu)建了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)[臨界標(biāo)準(zhǔn)：reliability > 0.7 and connectivity > 15 (node/edge)]將hub module中的基因識(shí)別為中心節(jié)點(diǎn)，并通過(guò)Cytoscape對(duì)其進(jìn)行可視化;對(duì)hub module中所有基因進(jìn)行基于TCGA數(shù)據(jù)的預(yù)后分析，八個(gè)基因（CLCN2，ERLIN2，F(xiàn)5，F(xiàn)AM107B，GFM1，HSPB3，METTL8和SYT3）與LSCC患者的預(yù)后相關(guān)，接下來(lái)對(duì)這8個(gè)基因進(jìn)行差異表達(dá)分析，六個(gè)基因（GFM1，HSPB3，SYT3，ERLIN2，METTL8和CLCN2）在LSCC組織中顯著差異表達(dá)。

6.  分析hub gene與臨床免疫指標(biāo)的相關(guān)性

根據(jù)cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)、TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述6基因進(jìn)行進(jìn)一步分析，并且計(jì)算了與CD8 + T細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)METTL8，HSPB3和ERLIN2）浸潤(rùn)水平之間的顯著相關(guān)。

7.  鑒定預(yù)后標(biāo)志物

通過(guò)基于GENT2數(shù)據(jù)庫(kù)的Meta生存分析，分析了METTL8，HSPB3和ERLIN2。 結(jié)果表明，METTTL8和HSPB3的有較大的預(yù)后價(jià)值。 使用Kaplan–Meier檢測(cè)了METTL8，HSPB3和ERLIN2的預(yù)后價(jià)值，結(jié)果表明METTL8和ERLIN2與負(fù)面預(yù)后顯著相關(guān)。接下來(lái)，選擇METTL8作為預(yù)后的生物標(biāo)志物，以進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

8.  預(yù)后標(biāo)志物METTL8基因富集分析

根據(jù)METTL8表達(dá)水平的中位數(shù)，將基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的LSCC表達(dá)圖譜分為高水平組和低水平組以進(jìn)行GSEA分析。

9.  預(yù)后標(biāo)志物METTL8的功能驗(yàn)證

在細(xì)胞中進(jìn)行METTL8的敲低，結(jié)果表明METTL8的敲低可能抑制細(xì)胞凋亡、增殖能力，影響細(xì)胞周期。

在小鼠異種移植成瘤實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行METTL8的干擾，結(jié)果表明METTL8的敲低抑制腫瘤生長(zhǎng)，一直細(xì)胞增殖和周期。

在正常肺組織與LSCC組織中檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)表達(dá)情況，與正常組織相比，LUSC組織中METTL8顯著高表達(dá)，CD8顯著低表達(dá)。

綜上， METTL8在LSCC腫瘤的免疫浸潤(rùn)中起關(guān)鍵作用。