導語：免疫檢查點阻斷療法已證明對多種癌癥類型具有良好的臨床效果。程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）是免疫檢查點，然而，由于耐藥性以及用于患者分層的生物標志物不足，僅少數患者從單藥治療中獲益，在很大程度上限制了臨床效應。這里，小編帶大家領略下小分子化合物的在耐藥方面的獨特魅力。

參考文獻：TYRO3 induces anti–PD-1/PD-L1 therapy resistance by limiting innate immunity and tumoral ferroptosis （IF=11.864）

技術路線：

結果：

1. TYRO3高表達與抗PD-1/PD-L1治療患者的預后不良相關

建立腫瘤小鼠體內耐藥模型，將4T1乳腺癌細胞接種到BALB/c小鼠的乳腺脂肪墊中，用抗PD-1（抗mPD-1）抗體治療，發現親代4T1(4T1-P)腫瘤對抗mPD-1治療有反應，腫瘤生長減少。相反，耐藥的4T1(4T1-R)腫瘤對抗mPD-1無反應。使用市售的RTK抗體陣列系統與4T1-P或4T1-R細胞的裂解物雜交，發現4T1-R細胞中TYRO3、EPHB2、FLT3和TRKA表達或磷酸化水平高于4T1-P細胞，TYRO3的增加最高。在接受抗PD-1抗體治療的黑色素瘤患者的生存數據中，較高的TYRO3表達水平與較短的總生存期相關，表明TYRO3表達與抗PD-1耐藥相關。TYRO3較高的表達與多種癌癥類型的較差預后相關。

檢測TYRO3基因拷貝數與細胞毒性T細胞抗腫瘤活性的相關性，CD8 + T細胞水平與高表達TYRO3基因的患者的生存期延長無關，但確實介導了低TYRO3基因拷貝數患者的生存期延長，表明TYRO3降低細胞毒性T細胞抗腫瘤作用的觀點。

為進一步確定TYRO3和抗PD-1治療結果之間的相關性，分析接受抗PD-1治療的黑色素瘤患者RNA-Seq數據中TYRO3的表達，發現耐藥腫瘤患者的TYRO3表達水平顯著高于腫瘤有反應的患者。Western blot分析也驗證了TYRO3，p-TYRO3在4T1-R克隆中的表達增強，說明TYRO3對配體刺激有反應。為進一步確定TYRO3和抗PD-1/PD-L1耐藥性在各種癌癥類型中是否普遍相關，我們研究了29例繼續接受抗PD-1/PD-L1治療患者的治療結果。抗PD-1/PD-L1治療耐藥患者的TYRO3表達水平高于對治療有反應的患者。

綜上所述，患者腫瘤組織中TYRO3的高表達和磷酸化與抗PD-1/PD-L1治療的耐藥性相關。

2. TYRO3使腫瘤細胞對抗PD-1治療耐藥

在同系BALB/c小鼠模型中比較了Tyro3過表達(Tyro3-OE)和4T1-P細胞對抗mPD-1治療的反應。在荷4T1-P腫瘤的小鼠中，抗mPD-1治療顯著減少腫瘤的生長，并延長了生存期。這些結果表明，盡管4T1-P腫瘤對抗mPD-1治療有反應，Tyro3的過表達促進了這些腫瘤的耐藥性。為進一步確定在4T1-R耐藥細胞中抗PD-1/PD-L1耐藥是否需要TYRO3，敲除4T1-R細胞(TYRO3–/–)中的TYRO3。荷瘤Tyro3敲低細胞的小鼠對抗mPD-1治療敏感，腫瘤生長顯著減少，小鼠存活時間更長。這些結果證明TYRO3在抗PD-1/PD-L1耐藥中的重要作用。

為理解TYRO3在抗PD-1/PD-L1耐藥中的機制作用，從4T1-P、TYRO3-OE、4T1-R和TYRO3–/–細胞中提取RNA進行全轉錄組分析。2種耐藥細胞系Tyro3-OE和4T1-R之間的轉錄組學變化高度相似，變化的重疊百分比較高，表明Tyro3在促進腫瘤細胞對抗PD-1/PD-L1治療耐藥中的作用。來自TCGA數據庫的黑色素瘤患者TYRO3基因的通路分析也顯示TYRO3表達與PD-1/PD-L1癌癥免疫治療通路呈正相關，與T細胞介導的抗腫瘤反應相關通路（CTL介導的細胞凋亡和死亡受體信號），炎癥反應相關通路（Th1活化、Th2活化、NF-κB信號）呈負相關。HMGB1是一種損傷相關分子模式分子，由嗜鐵細胞釋放，我們發現HMGB1信號與TYRO3表達呈負相關。以上表明，TYRO3在抗PD-1/PD-L1耐藥中的作用，并表明TYRO3有利于抗炎TME。

3. TYRO3通過抑制鐵死亡和腫瘤TME，誘導抗PD-1/PD-L1耐藥性。

為探究TYRO3在TME中的功能，首先評估了TYRO3-OE 4T1和4T1-P腫瘤之間免疫學特征的整體變化。免疫細胞譜分析發現在CD45-腫瘤細胞中，Tyro3過表達與PD-L1或caspase-3無關，Tyro3-OE腫瘤中M1樣巨噬細胞水平降低，M1/M2比值下降，提示腫瘤表達的Tyro3促進M1～M2巨噬細胞極化。用TYRO3-OE BT549細胞或TYRO3-OE和TYRO3–/–4T1腫瘤細胞的條件培養基孵育THP1單核細胞或骨髓源性巨噬細胞，進一步驗證TYRO3的體外抗炎功能。RNA-Seq發現VEGF在耐藥細胞系4T1-R和Tyro3-OE中表達上調，TYRO3-OE BT549細胞的條件培養基CM顯著降低M1標記物的表達，增加M2標記物的表達，加入VEGFR抑制劑完全消除TYRO3對巨噬細胞極化的影響。這些結果表明TYRO3通過上調VEGF降低M1/M2比值，從而促進原瘤TME。

在TYRO3-OE 4T1腫瘤細胞中，阻斷鐵死亡的基因上調（Slc40a1、Slc7a11、Slc3a2、Gpx4、Fth1和Blvrb），而增強鐵死亡的基因下調（Slc5a1、Tfrc）。在接受抗PD-1治療的黑色素瘤患者中，阻止脂質過氧化和鐵死亡的分子SLC3A2與TYRO3顯著共表達。抗PD-1治療后，Tyro3-OE CD45-腫瘤細胞的脂質ROS水平低于4T1-P CD45-腫瘤細胞，而加入抗PD-1顯著增加4T1-P腫瘤細胞的脂質ROS，但不增加Tyro3-OE腫瘤細胞的脂質ROS，表明Tyro3抑制抗PD-1誘導的腫瘤細胞鐵死亡。在體外用鐵死亡誘導劑erastin和鐵死亡抑制劑ferrostatin 1(Fer-1)處理4T1-P和Tyro3-OE 4T1細胞。與親代細胞相比，Tyro3過表達抑制了鐵死亡誘導劑誘導的細胞死亡。當Fer-1阻斷鐵死亡時，Tyro3過表達抑制誘導劑誘導的脂質ROS。Tyro3缺失增加了誘導劑誘導的細胞死亡和脂質過氧化，Fer-1消除了這些作用。這些結果表明TYRO3對于保護腫瘤細胞免受鐵死亡至關重要。

NRF2是阻斷鐵死亡的關鍵介質，TYRO3過表達的293T細胞中NRF2轉錄活性增加。TAM激酶下游的PI3K/AKT信號通路可增加NRF2轉錄活性，TYRO3-OE介導的NRF2轉錄激活被AKT抑制劑MK2206消除。這些結果表明TYRO3通過AKT/NRF2軸抑制鐵死亡。
吞噬細胞對瀕死細胞的清除依賴于對凋亡細胞暴露的“吃我信號”的識別。磷脂酰絲氨酸(PS)是一種關鍵的“吃我”分子，可與橋接分子結合，如TAM激酶配體蛋白S(Pros1)和Gas6。Pros1在與PS結合時同時激活TYRO3。Pros1處理4T1和PY8119腫瘤細胞可抑制erastin誘導的脂質過氧化作用，表明凋亡細胞的Pros1“吃我”信號可以通過TYRO3抑制腫瘤細胞鐵死亡。

綜上所述，這些發現表明TYRO3抑制腫瘤細胞鐵死亡，并通過降低M1/M2比值支持原瘤TME。此外，腫瘤細胞可能利用鄰近瀕死細胞的Pros1“吃我”信號，通過激活TYRO3，抑制鐵死亡，促進腫瘤細胞的存活。

4. 抑制TYRO3可增強鐵死亡，使耐藥腫瘤對抗mPD-1治療敏感

TYRO3抑制劑LDC1267處理4T1-R細胞，有效降低了TYRO3磷酸化、，增加腫瘤細胞死亡和脂質過氧化，而在Tyro3-/-細胞中不存在該作用，表明抑制TYRO3可增強腫瘤細胞鐵死亡。荷4T1-R腫瘤的小鼠腹腔注射抗mPD-1、LDC1267或其組合，聯合給藥顯著降低了腫瘤生長，并延長小鼠生存期。此外，腎功能和肝功能的生化指標均在其正常范圍內，證明聯合給藥在動物中耐受良好。這些結果表明靶向TYRO3聯合抗PD-1有可能克服抗PD-1/PD-L1耐藥性，且毒性水平相對較低。

結論：TYRO3抑制腫瘤細胞鐵死亡，通過促進M1到M2極化有利于原腫瘤TME，在抗PD-1治療期間促進腫瘤存活。