散發(fā)性克雅氏病(sCJD)表現(xiàn)為一種傳染性的，快速進(jìn)行性癡呆，生存期短。代表性的病理特征是腦灰質(zhì)海綿狀變化,并伴有異常形式的朊病毒蛋白(PrP)的沉積。腦核磁共振成像(MRI)和腦脊液(CSF)分析是常用的診斷方法。目前，還沒(méi)有用于診斷或疾病監(jiān)測(cè)的臨床血液檢測(cè)。miRNAs（microRNAs）,可以抑制目標(biāo)mRNA轉(zhuǎn)錄本的翻譯并標(biāo)記其降解。miRNA的失調(diào)已在疾病狀態(tài)中被廣泛描述。近期發(fā)表Nature Communications（IF=12.121）上的文章分析了sCJD中血液miRNA的表達(dá)，并評(píng)價(jià)了其作為sCJD診斷的價(jià)值。
技術(shù)路線圖：

研究結(jié)果：
1.在sCJD血液中，小RNA測(cè)序鑒定5個(gè)差異表達(dá)miRNAs（DE miRNAs）
    病例對(duì)照研究57例sCJD患者和48例對(duì)照組的血液(表1)。測(cè)量了所有樣本中的miRNAs。圖1a顯示,四個(gè)microRNA有統(tǒng)計(jì)上顯著變化。圖1b顯示，與健康對(duì)照相比，sCJD中hsa-miR-16-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-106b-3p和hsalet-7i-5p下調(diào)，包括hsa-let-7d-3p。使用這五種差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行的無(wú)監(jiān)督層次聚類分析產(chǎn)生了兩個(gè)主要的樣本聚類，大多數(shù)健康個(gè)體緊密地聚類在一起(圖1c)。

2.sCJD 差異表達(dá)在獨(dú)立隊(duì)列中復(fù)制
    使用獨(dú)立隊(duì)列和技術(shù)驗(yàn)證和重復(fù)這些結(jié)果。重復(fù)隊(duì)列包括29名sCJD患者和30名健康 (表1)。RT-qPCR檢測(cè)顯示sCJD血液中hsa-let-7i-5p、hsa-miR-16-5p和hsa-miR-93-5p水平較低，而hsa-miR-484如預(yù)期保持不變(圖2a)，與上述研究結(jié)果一致。在其余兩種被檢測(cè)的miRNA中，hsa-miR-106b-3p沒(méi)有擴(kuò)增，而hsa-let-7d-3p與上述結(jié)果不相符(圖2a)。
    我們推測(cè)，如果差異miRNA表達(dá)在sCJD的外周病理生理中發(fā)揮作用，那么sCJD血液中的相關(guān)mRNA靶點(diǎn)也應(yīng)該發(fā)生改變。我們使用TarBase鑒定這些mRNA靶點(diǎn)(使用熒光素酶分析和/或免疫沉淀驗(yàn)證);RT-qPCR檢測(cè)重復(fù)隊(duì)列中報(bào)道的由hsa-let-7i-5p、hsa-miR-16-5p和hsamiR-93-5p控制的6個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá):CCND3、VEGFA、NAP1L1、ZFP36、CDKN1A和RNF44。圖2b顯示，與對(duì)照組的血液相比，sCJD患者的血樣中有四個(gè)轉(zhuǎn)錄本水平升高，這與沉默miRNA之后靶mRNA的表達(dá)升高是一致的。對(duì)差異表達(dá)(DE)microRNA的六個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析發(fā)現(xiàn)沒(méi)有顯著的富集。這些結(jié)果表明sCJD血液中hsa-let-7i-5p、hsa-miR-16-5p和hsamiR-93-5p表達(dá)下調(diào)，同時(shí)其所對(duì)應(yīng)的mRNA靶蛋白水平升高。

3.sCJD中，let-7i、miR-16和miR-93下調(diào)具有特異性
    為了進(jìn)一步研究這種基于血液的miRNA標(biāo)簽與sCJD的相關(guān)性，我們分析AD患者的血液 (相當(dāng)于sCJD患者第一次取樣) 中hsa-let-7i-5p、hsa-miR-16-5p和hsa-miR-93-5p的水平。30個(gè) AD患者的性別和年齡與對(duì)照組匹配用于復(fù)制分析(表1)。RT-qPCR數(shù)據(jù)表明，與sCJD形成鮮明對(duì)比,hsa-let-7i-5p, hsa-miR-16-5p和hsa- mir-93-5p在AD患者中升高（圖3）。這些結(jié)果表明，血液中hsa-let-7i-5p、hsa-miR-16-5p和hsa-miR-93-5p的水平建立了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，可以區(qū)分健康對(duì)照、AD和sCJD。

4.對(duì)sCJD血液中DE miRNA表達(dá)的縱向評(píng)價(jià)
    雖然疾病指標(biāo)和DE miRNAs之間沒(méi)有代表性的相關(guān)性，但我們猜想是否miRNA表達(dá)下降的速度與sCJD患者中觀察到的下降速度有關(guān)。高的個(gè)體間變異可能會(huì)模糊隨著時(shí)間的推移個(gè)體內(nèi)的縱向影響。從21個(gè)sCJD個(gè)體縱向收集了50份血液(MRC朊病毒疾病評(píng)級(jí)量表評(píng)估每位患者的病情，以便監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展情況)。RT-qPCR檢測(cè)的hsa-let-7i-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-93-5p和hsa-miR-484（sCJD血液中未發(fā)生變化）的表達(dá)水平，并將其轉(zhuǎn)化為表達(dá)下降率。圖4a-d顯示，hsa-let-7i-5p、hsa-miR- 16-5p和hsa-miR-93-5p水平的下降率與疾病進(jìn)展率(每天功能損失%)無(wú)關(guān)。

5. miRNA標(biāo)記的診斷潛力
    為了評(píng)估m(xù)iRNAs區(qū)分sCJD病例和健康對(duì)照的能力，進(jìn)行了ROC分析。
    比較sCJD和健康對(duì)照，曲線下面積(AUCs)范圍從0.736 (has-let-7i-5p)到0.762 (hsa-miR-16-5p)，當(dāng)三種miRNA合并時(shí)，曲線下面積(AUCs)達(dá)到0.788(圖5a);在復(fù)制集中采用相同的方法，三種miRNAs聚合后的表現(xiàn)均優(yōu)于各自的表現(xiàn)(圖5b)。我們發(fā)現(xiàn)hsa-let-7i-5p, hsa-miR-16-5p和hsa-miR-93-5p是在AD患者中表達(dá)上調(diào)(相反，在sCJD中表達(dá)下調(diào))，接下來(lái)我們分別使用這三種miRNA并將其聚合，進(jìn)行了同樣的分析(即將AD與健康對(duì)照進(jìn)行比較)。圖5c顯示，三種miRNA的曲線下面積(AUC)值在0.810 (hsa-miR-93-5p)到0.859 (hsa-miR-16- 5p)之間，三種miRNA的曲線下面積(AUC)之和達(dá)到0.860，具有較好的診斷鑒別性。最后，由于缺乏在血液中特異性和選擇性地區(qū)分sCJD患者和AD患者的生物標(biāo)志物，我們計(jì)算了sCJD和AD的AUCs比較。值得注意的是，曲線下面積(AUC)的范圍為0.897 (hsa-miR-93-5p)至0.934 (hsa-let-7i-5p)。將這3個(gè)miRNA結(jié)合，曲線下面積(AUC)值為0.924，特異性為100%(圖5d)。，這些結(jié)果表明，這些血液miRNA表達(dá)標(biāo)記可用于區(qū)分AD和健康對(duì)照，sCJD和AD

總結(jié)：
    最后，miRNA在鑒別sCJD和阿爾茨海默病中顯示了較高的準(zhǔn)確性。這些發(fā)現(xiàn)突出了sCJD外周的分子改變，為鑒別診斷提供了信息，并提高了對(duì)人類朊病毒疾病機(jī)制的理解