阿霉素(DOX)是目前最有效的抗腫瘤藥物之一，但是因為它有嚴重心臟毒性風險，所以其臨床應用受到限制。前人的研究已經確定CircITCH是一種廣譜的腫瘤抑制環狀RNA，其宿主基因ITCH參與了doxbicin誘導的心臟毒性(DOXIC)。CircITCH是否在DOXIC中起作用還不清楚。本文為解決這一問題提供了部分答案，并于2020年5月11日發表于《Circulation Research》IF：14.467期刊上。
技術路線如下：

本文結果如下：
1、CircRNA在人類DOXIC處理和健康心臟組織中的表達模式
    為了篩選潛在的候選circRNA，對3例DOX誘導的心肌病人組織和3里非疾病健康捐贈者的心臟組織進行circRNA表達譜測序。如圖1A所示，獲得了19112個circRNAs，其中84.93來自與外顯子基因組。另外，在兩組間差異表達的circRNA有356個，207個在病人中上調，149個下調（Fig. 1B）。對最顯著上調的差異circRNA進行PCR數據庫驗證，發現hsa_circ_0001141，其宿主基因ITCH下調并參與DOXIC，因此，作者初步選定ITCH來源的circRNA。
    對5個ITCH來源的circRNAs亞型的驗證表明hsa_circ_0001141是僅有的一個富集趨勢符合預期的亞型，將其命名為CircITCH。隨后驗證了其首尾相接的環形結構和大小（Fig. 1C-F）。亞細胞定位顯示CircITCH主要分布于細胞質，暗示可能吸附miRNA發揮作用。隨后，實驗發現DOX處理后CircITCH的表達顯著下降（Fig. 1I-K）。這些數據暗示CircITCH在DOXIC中發揮作用。

圖1 CircITCH表達模式在DOXIC在人類樣本

2、CircITCH過表達減輕了DOX誘導的細胞死亡，收縮功能障礙和鈣處理缺陷
    隨后作者探究了CircITCH在DOX誘導的hiPSC-CMs損傷和功能異常中的作用。為此，使用三種正常的iPSC細胞系和五批基于單分子層的心肌分化方案來生成hiPSC-CM。在hiPSC-CM分化后的30-35天使用CircITCH表達的腺病毒轉導至葡萄糖饑餓純化的hiPSC-CM中，并檢測到CircITCH的高表達，而ITCH的表達無變化。同時使用CircITCH-ir沒有下游反向序列做對照。將上述構建的細胞暴露于DOX，檢測到CircITCH在hiPSC-CMs中過表達可以防止細胞活性喪失(Fig. 2A-D)。CircITCH過表達也能抑制乳酸脫氫酶(LDH)滲漏、心肌細胞壞死指數和EthD1陽性死亡細胞數(Fig. 2B, E-F)。
    DOX處理后在hiPSC-CMs細胞中觀察到單層的收縮/松弛速度和變形距離顯著下降，而CircITCH過表達能顯著阻止上述趨勢，并且DOX處理的hiPSC-CMs細胞的收縮特性都得到明顯改善(Fig. 2G-I)。此外，作者在單細胞水平進行了鈣離子成像檢測，與上述結果一致，DOX可降低hiPSC-CMs的鈣波幅并引起舒張期鈣超載，相反的，CircITCH過表達緩和上述改變(Fig. 2J-L)。這些結果證明CircITCH過表達保護免受DOX誘導的hiPSC-CMs細胞損傷和功能異常。

圖2 CircITCH減輕了DOXIC在hiPSC-CMs的作用和改善其功能

3、CircITCH過表達可緩解DOX對hiPSC-CMs細胞/線粒體的氧化應激和DNA損傷
    為了探究CircITCH引起的心肌保護機制，接下來評估hiPSC-CMs細胞的氧化應激和DNA損傷水平，這是DOXIC相關的兩個主要的指標。與此前的報道一致，DOX處理引發DNA雙鏈斷裂（DSB），導致γ-H2AX陽性細胞的比例增加(Fig. 3A, C, D)，該結果可通過ATM磷酸化增加證實(Fig. 3 B, E, F)。另一個DNA損傷的指標，8-OHdG泄露，其結果與上述一致(Fig. 3J)。此外，CircITCH過表達可以減緩線粒體DNA損傷(Fig. 3I)。類似的，DOX處理增加了線粒體和細胞的氧化應激，但CircITCH過表達可以部分消除這種反應(Fig. 3 G, H, K)。

圖3 CircITCH可緩解DOX對hiPSC-CMs細胞/線粒體的氧化應激和DNA損傷

4、CircITCH保護免受DOXIC通過miR-330-5p
    通過對RegRNA 2.0和CircInteractome的預測結果進行重疊獲得了8個CircITCH潛在的靶向miRNA (Fig. 4A)。生物素標記的CircITCH探針pull-down實驗，檢測到miR-330-5p, miR-214-3p, miR-7-5p, 和miR-1296的顯著富集(Fig. 4B-E)。熒光素酶實驗發現miR-330-5p最能顯著改變熒光素酶活性。此外，生物素偶聯miR-330-5p比生物素偶聯突變體探針捕獲更多CircITCH (Fig. 4 F, G)，FISH顯示CircITCH和miR330-5p存在共定位(Fig. 4H)。這些結果驗證了miR330-5p可以在hiPSC-CMs中與CircITCH結合。

圖4 CircITCH在hiPSC-CMs中起著內源性miR-330-5p海綿的作用

5、MiR-330-5p在dox處理的hiPSC-CMs中上調，其沉默可防止DOXIC
    如圖Fig. 5A所示，DOX處理后miR-330-5p的表達顯著上調。因此，隨后進行了miR-330-5p的抑制實驗，結果表明，抑制miR-330-5p后細胞活力增強，細胞死亡減少，LDH泄露降低，改善hiPSC-CMs的收縮和舒張速度，提高鈣波幅，降低舒張期鈣超載，減弱細胞和線粒體DNA損傷，抑制細胞和線粒體氧化應激，其效果與CircITCH過表達一致(Fig. 5B-M)。這些結果表明抑制miR-330-5p可以顯著抑制hiPSC-CMs中的DOXIC。

圖5 MiR-330-5p在dox處理的hiPSC-CMs中上調，其沉默可防止DOXIC

6、在DOX暴露的hiPSC-CMs細胞中，SIRT6、BIRC5和ATP2A2直接靶向miR-330-5p，并受到CircITCH/miR-330- 5p軸調控
    如圖6A所示，GSE數據庫GSE79413, GSE64476, 和GSE97642這三個數據庫重疊的組合識別出84個miR-330- 5p的候選靶標。隨后通過PCR芯片，鑒定miR-330- 5p下調靶基因和DOX處理下調靶基因的重合基因，得到三個候選目標分子SIRT6、BIRC5和ATP2A2，隨后進行熒光素酶報告基因驗證，發現miR-330- 5p可以有效降低上述三個報告載體的熒光活性，而結合位點突變后熒光素酶活性沒有顯著改變，證明三個分子與miR-330- 5p具有結合作用(Fig. 6C-E)。

圖6 在DOX處理的hiPSC-CMs中，miR-330-5p直接作用于SIRT6、BIRC5和ATP2A2

7、CircITCH改善小鼠DOXIC
    為了在體內進一步驗證CircITCH是否參與DOXIC調節，使用AAV9載體系統在小鼠中過表達CircITCH。過表達效率如圖7B所示。在急性小鼠模型中，HE染色觀察到CircITCH的過表達減少了DOX誘導的心室組織廣泛空泡化(Fig. 7C, D)。提示心肌損傷的心肌酶研究顯示，CircITCH過表達有效地降低了DOX誘導的血清天冬氨酸轉氨酶(AST)、LDH和肌酸激酶(肌/腦)水平(Fig. 7E-G)。此外，功能性心肌研究顯示，包括超聲心動圖和侵入性血流動力學方法，證明CircITCH過表達顯著提高了由阿霉素誘導降低的左心室射血分數(LVEF)、左心室部分縮短(LVFS)，左心室收縮末期和舒張末期壓力(LVESP)和一階導數的LV壓力，但過表達降低了DOX引起的左心室舒張末期壓力(LVEDP)的升高(Fig. 7H-O)。這些結果表明CircITCH在小鼠體內同樣具有保護免受DOXIC傷害的作用。

圖7 AAV9介導的CircITCH過表達可改善小鼠DOXIC

    總之，如圖8所示，CircITCH發揮其潛在功能，作為ceRNA來吸附miR-330-5p，從而激活miR-330-5p靶標SIRT6，BIRC5（Survivin）和ATP2A2（SERCA2a），從而通過改善DOXIC通過減少氧化壓力和DNA損傷，細胞死亡，收縮功能障礙和鈣處理缺陷。
    此外，CircITCH被證實是各種實體瘤中的抑癌劑（右上）。 因此，本文揭示了CircITCH在DOXIC進展中的新作用，并將其確定為促進基于阿霉素的化學療法的有希望的治療劑。 因此，CircITCH具有一箭雙雕的作用，即增強腫瘤抑制作用，同時降低化學療法的心臟毒性。

圖8 假設示意圖

參考文獻：

Han Dong., Wang Yongjun., Zhang Jibin., Dai Xinchun., Zhou Tingwen., Chen Jiangwei., Tao Bo., Wang Yabin., Cao Feng.(2020). The Tumor-Suppressive Human Circular RNA CircITCH Sponges miR-330-5p to Ameliorate Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity Through Upregulating SIRT6, Survivin, and SERCA2a. Circ. Res., undefined(undefined), undefined. doi:10.1161/CIRCRESAHA.119.316061