circRNA主要存在于細胞質或外泌體中，具有組織特異性、疾病特異性、時序特異性及高穩定性等特征。大量研究表明circRNA通過調控細胞生長、分化、遷移、侵襲以及調亡等多種生物學過程參與了癌癥的發展，并預測了其在疾病診斷和治療標志物等方面的應用前景。目前對circRNA的生物學功能和調控機制還知之甚少。近期北京大學深圳醫院泌尿研究所的桂耀庭團隊描述circTLK1在腎癌細胞（RCC）中的表達特征，并分析和闡述了其與miR-136-5p/CBX4的ceRNA調控機制如何影響RCC細胞的增殖、遷移、侵襲以及轉移的。該研究表明circTLK1可能成為RCC的預后標志物和治療靶點。相關研究結果以“CircTLK1 promotes the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma by sponging miR-136-5p”為題發表在Molecular Cancer雜志上，雜志影響因子15.302。
背 景：
    大量研究證明circRNA是腫瘤發生和進展的可能生物標記物和重要的調控因子。然而circRNA在RCC中的作用很大程度上仍然是未知的。
材 料：
    RCC組織和正常腎組織，人RCC細胞系，人腎上皮細胞細胞系，小鼠動物模型。
方 法：
    circRNA-seq，shRNA，RNase R實驗，CCK-8 assay，colony-formation assay，細胞劃痕實驗， transwell，FISH，RNA pull-down，熒光素酶報告基因實驗，WB，免疫熒光，免疫組化。
結 果：
    發現circTLK1在RCC中表達上調，其表達與遠處轉移和不良預后呈正相關。circTLK1沉默可顯著抑制RCC在體內外的增殖、遷移和侵襲。circTLK1主要分布在細胞質中，作為miR-136-5p的海綿正向調控CBX4表達。CBX4過表達能逆轉circTLK1沉默誘導的RCC細胞表型抑制。因此，circTLK1通過作為miR-136-5p的海綿調控CBX4表達的方式在RCC發展中起重要作用。
研究思路：

1.篩選和鑒定RCC中高表達的circRNA
    circRNA已被證明在腫瘤發生、發展過程中有重要作用。作者通過RNA-seq篩選了在RCC細胞中與正常腎上皮組織細胞高度差異表達的circRNA（a）。通過生信分析和qPCR驗證發現circTLK1在RCC細胞中上調最明顯，在RCC組織和術后轉移的RCC病人中高表達，并與RCC患者總生存率和無進展生存率呈負相關（b-e）。Sanger鑒定和RNase R實驗驗證了circTLK1的環狀結構（g,i）。

2.circTLK1敲除抑制RCC細胞的增殖、遷移和侵襲
    確定circTLK1的表達特征和結構后，接下來探究circTLK1在RCC細胞中的具體作用。利用ShRNA抑制circTLK1在RCC細胞系中的表達，發現并不改變TLK1的表達（a-c）；CCK8和克隆形成實驗驗證RCC細胞的增殖受到抑制（d-f）。

    利用細胞劃痕實驗和transwell發現在circTLK1敲除后，RCC細胞的遷移和侵襲受到抑制（a-d）。說明circTLK1參與RCC細胞的增殖、遷移和侵襲過程。

3.circTLK1的海綿基因鑒定
    細胞定位決定基因的功能方向，利用FISH和核質分離PCR確定circTLK1定位于細胞質（a-b），推測它可能是作為miRNA的海綿發揮功能。通過生物信息學分析篩選5個可能結合的miRNA，利用RNA pull-down和熒光素酶報告實驗確定與circTLK1結合的miRNA是miR-136-5p（c-f），且敲除和過表達實驗驗證circTLK1和miR-136-5p互不改變彼此的表達（f-j），說明circTLK1對miR-136-5p具有海綿的作用。

4.miR-136-5p的下游靶基因CBX4的鑒定以及CBX4對RCC細胞增殖、遷移和侵襲的影響
    通過生物信息學篩選了miR-136-5p可能的靶基因（a），其中CBX4的表達與miR-136-5p呈負相關（b）。熒光素酶報告基因實驗驗證與miR-136-5p結合的是CBX4 （c-d），且miR-136-5p過表達抑制CBX4的表達（e-g）。此外，CBX4在RCC組織中表達是上調的，并與腫瘤大小、術后轉移呈正相關，與RCC患者總生存率呈負相關（h-k）。

    敲除CBX4（a），通過CCK-8、克隆形成、細胞劃痕、transwell等實驗驗證了CBX4沉默抑制了RCC細胞的增殖、遷移和侵襲（b-i），同時發現CBX4的敲除抑制VEGFA的表達（j-K）。說明CBX4是miR-136-5p的靶基因，并參與調控RCC細胞的增殖、遷移和侵襲過程。

5.過表達CBX4可逆轉circTLK1沉默導致的細胞增殖和轉移抑制的影響
    為了研究CBX4與circTLK1的相互作用，作者敲除circTLK1，WB檢測發現CBX4的表達顯著性被抑制（a,b），過表達CBX4，發現其可以逆轉circTLK1沉默誘導的RCC細胞增殖、遷移和侵襲抑制作用（c-K）。證明circTLK1/miR-136-5p/CBX4之間存在ceRNA調控機制，該機制參與調控RCC細胞增殖、遷移和侵襲過程。

6.circTLK1敲除抑制小鼠模型中RCC細胞的生長和轉移
    為了探究circTLK1在體內對RCC細胞生長和轉移的作用，構建了shcircTLK1和shNC異種移植腫瘤和肺轉移小鼠模型。研究發現，circTLK1敲除顯著性減少腫瘤的體積和重量（a-c），同時抑制了CBX4和VEGFA的表達（d-e）。肺轉移模型中，circTLK1沉默顯著減弱了肺部腫瘤轉移（f-h）。同時，在腫瘤模型中過表達CBX4可以逆轉circTLK1沉默誘導的RCC細胞生長抑制（i）。證明circTLK1/miR-136-5p/CBX4/VEGFA調控機制可能在促進體內RCC細胞的生長和轉移過程中有重要的作用。

7. circTLK1/miR-136-5p/CBX4/VEGFA調控機制圖

參考文獻：
    Jianfa Li, Chenchen Huang, Yifan Zou et al. CircTLK1 promotes the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma by sponging miR-136-5p. Mol Cancer. 2020; 19(103).