高于30%的轉移性乳腺癌病人最終會發展成為顱內轉移，但是這是如何發展的，其病理機制還不是很清楚。鑒于此，Kounosuke Watabe教授帶領其團隊探究了乳腺癌的顱內轉移的過程，并于2018年7月19日發表于Cancer Research雜志（IF=9.1）。本次研究首先在原發性乳腺癌組織和乳腺癌的顱內轉移腫瘤組織做了lncRNA表達譜，并發現X-inactive–specific transcript（XIST）在這兩種組織中下調最顯著。然后作者進行了XIST功能的探究，發現XIST表達水平與顱內轉移存在負相關性，但是與骨轉移沒有相關性。當沉默XIST后能夠優先促進異種移植模型中的顱內轉移瘤的生長。進一步，作者在小鼠乳腺中特異性敲除XIST，發現這能加速原發性乳腺癌腫瘤的生長和顱內轉移的發生。同時，下調XIST能夠通過MSN調節蛋白刺激上皮間質轉換（EMT）和激活c-Met，這便會增加腫瘤細胞多能性。下調XIST也能夠分泌攜帶miR-503的外泌體，這能夠啟動小神經膠質細胞M1-M2的極化。M1-M2的改變能夠增加小神經膠質細胞中免疫抑制因子的表達，最終抑制T細胞的增殖。作者又進一步篩選了FDA-批準的藥物庫，并且識別了氟達拉濱可以作為低表達XIST的乳腺癌的合成致命藥物，并且還發現氟達拉濱能夠在小鼠模型中抑制乳腺癌的顱內轉移。

這篇文章的結果揭示了XIST通過影響腫瘤細胞和腫瘤微環境，最終在乳腺癌的顱內轉移中具有關鍵性的作用。同時，XIST調節的信號通路也可能作為治療乳腺癌的顱內轉移的有效靶點。

技術路線

結果
1. XIST在乳腺癌的顱內轉移中的表達是下調的。

圖1. X染色體上的XIST的下調與顱內轉移正相關。

A. 樣品示意圖和lncRNA分析（原發性乳腺癌組織點（n=11）、乳腺癌的顱內轉移組織點（n=13）被切下，顯微切割去得到腫瘤細胞，提取RNA，檢測92個關鍵的與癌癥相關的lncRNA）。B. TaqMan PCR檢測XIST在臨床樣本中的表達。 C. qPCR檢測在兩對優先轉移顱內的細胞系中XIST的表達。D. 通過GEO數據庫，Kaplan–Meier分析顱內轉移的病人與死亡的關系（n=710）。E. 通過GSE14018數據庫檢測發生腫瘤轉移乳腺癌病人中XIST的表達。F. 通過TCGA據庫檢測亞型乳腺癌病人中XIST的表達。

2. 在體內，XIST優先抑制腫瘤的顱內轉移。

圖2. 在體內，下調XIST能夠促進腫瘤的顱內轉移。

A-H. 正常或下調XIST的MCF7和SKBR3注射到小鼠心臟中。qPCR檢測MCF7和SKBR3細胞下調XIST的效率（A、E）。下調XIST后，每一周檢測一次luciferase信號反應腫瘤生長情況（B、F）。Kaplan–Meier分析顱內轉移和生存之間的關系（C、G）。28天后處死小鼠，大腦內的luciferase信號被檢測（D、H）。I. qPCR檢測231BrM-dXIST#11的表達。 J-L. 通過心臟注射，將231BrM-dCTRL和231BrM-dXIST#11細胞接種到裸鼠體內，監測腫瘤生長（J）。Kaplan–Meier分析顱內轉移和生存之間的關系（K）。28天后處死小鼠，大腦內的luciferase信號被檢測（L）。M. 正常或下調XIST的MCF7和ZR75-1細胞原位移植裸鼠乳房脂肪墊中，通過BLI檢測原發性腫瘤的生長。N. 移植5周后檢測顱內轉移發生率。O. 通過心臟注射將MCF7-shCTRL 和 MCF7-shXIST細胞轉移到裸鼠大腦中，通過lVlS檢測腫瘤生長。P. 來自腫瘤模型的小鼠的大腦的量化。

3. 乳腺特異性敲除XIST能夠提高顱內轉移。

圖3. 在MMTV-PyMT模型中敲除XIST后促進顱內轉移。

A. 正常表達和敲除XIST的乳腺的圖片（Age=3W）。B. A圖中乳房的腫瘤結節被統計。C. 20周后計算腫瘤的體積。D. IHC檢測來自正常表達和敲除XIST的PyMT小鼠的原發性腫瘤中CK14和CK8/18的表達。E. 正常表達和敲除XIST的MMTV-PyMT的腫瘤遠距離轉移率。F. 24-28周，ICH檢測CK14和mT-抗原顯示腫瘤的微轉移率。G. 小鼠大腦微轉移的數量。H. qPCR檢測mT-抗原在小鼠大腦中的表達。I. Kaplan–Meier 分析顱內轉移和Py216 and Py222細胞孵育的C57/B6小鼠生存率的關系。J. 28天后處死小鼠，大腦內的luciferase信號被檢測。K. 蘇木精和尹紅染色孵育Py222細胞的小鼠顱內轉移瘤。

4.下調XIST能夠促進腫瘤EMT和多能性。

圖4.下調XIST啟動子促進腫瘤EMT和多能性。

A. MCF7-shXIST 和 ZR75-1-shXIST細胞在形態學上改變的圖片。B-E. qPCR（B）、WB（C）、免疫組化（D）檢測EMT marker（E-cadherin 和vimentin）。E. 正常表達或下調的XIST后7天的MCF7 和ZR75-1細胞的形態學圖片（左），球體的數量被統計（右）。F. 通過將MCF7-shCTRL和MCF7-shXIST細胞注射到裸鼠乳腺脂肪墊中，進行有限稀釋實驗檢測腫瘤啟動能力和測量腫瘤的形成。G. 正常表達或下調XIST的 MCF7 和 ZR75-1細胞進行移行分析實驗。

5.下調XIST能夠通過MSN的上調激活c-Met信號通路。

圖5. XIST通過MSN調節c-Met的表達。

A. 在TCGA中乳腺癌病人被分為高表達XIST（高于30%）組和低表達XIST（低于30%）組，然后進行GSEA對119個促癌通路進行分析。結果顯示HGF/c-Met通路的富集程度最高。B. WB檢測正常表達或下調XIST的3種不同的乳腺癌細胞系中c-Met的表達。C. 在發生顱內轉移瘤的病人中，TaqMan qPCR檢測XIST的表達，IHC檢測c-Met蛋白的表達。通過卡方計算2 XIST表達和c-Met表達的相關性。D. MCF7-shCTRL 和MCF7-shXIST 細胞的表達譜分析的流程圖。E. qPCR檢測MCF7-shCTRL 和MCF7-shXIST細胞中MSN、MID1 和MPP1的表達。F.在MCF7-shXIST 和SKBR3-shXIST細胞中下調MSN后，WB檢測MSN和c-Met的表達。G. 免疫組化檢測正常表達或下調XIST或MSN的MCF7細胞。H. 在231BrM細胞中下調MSN后，WB檢測MSN和c-Met的表達。J. WB檢測正常表達或下調XIST的231BrM和SKBrM3細胞中c-Met和MSN的表達。K. 免疫組化檢測正常表達或下調XIST的231BrM細胞。L. WB檢測加或不加四環素的MCF7-shXIST/Dox/sh-Met細胞中 c-Met的表達。M. 加或不加四環素的MCF7-shXIST/Dox/sh-Met細胞進行移行實驗。N. 進行小鼠心臟接種MCF7-shXIST/Dox/sh-Met細胞，并且進行四環素治療（將四環素加到小鼠的引用水中），分析大腦（左）和骨骼（右）內轉移瘤和生存的關系。O. 最后進行BLI拍照。P. 來自于大腦和骨骼的內轉移瘤小鼠模型中BLI的定量。

6.在腦中，低表達XIST的細胞能夠分泌攜帶miR-503的外泌體，進一步重編碼小神經膠質細胞。

圖6. 來自低表達XIST細胞的外泌體能夠攜帶miR-503逆轉小神經膠質細胞從M1-M2極性表型的改變。

A.在低表達和高表達XIST的病人中，通過GSEA檢測了來自MSigDB數據庫的95個與免疫相關的信號通路。先天性免疫富集程度最高。C. qPCR檢測加入或不加入外泌體的SIM-A9細胞中（小鼠小神經膠質細胞系）CD86和ARG1的表達。D. 外泌體miRNA的表達譜分析流程圖。E. TaqMan-qPCR檢測正常表達或下調XIST的兩對肺癌細胞系中miR-503的表達情況。F. 從MCF-shXIST細胞培養基中分離外泌體然后進行含有PalmGFP的慢病毒載體進行熒光標記。外泌體共孵育SIM-A9細胞，檢測小神經膠質細胞中的GFP熒光。G. 在患有乳腺癌的病人中，使用GSE22220數據庫在復發和生存之見檢測miR-503的表達。H. 使用Exoquick試劑盒提取發生顱內轉移和未發生顱內轉移的病人的血清中提取外泌體。提取外泌體中的RNA后，進行TaqMan qPCR檢測miR-503的表達。I. 從MCF7-shCTRL, MCF7-shXIST 和MCF7-shXIST/Anti-miR503細胞的上清液中提取外泌體，孵育SIM-A9細胞后，qPCR檢測M1(CD86)和M2(CD204,ARG1)的markers。J. qPCR檢測表達或不表達miR-503的SIM-A9細胞中的M1(CD74,CD80,CD86)和M2(CD204,ARG1/2,IL10)的 markers。K. WB檢測表達或不表達miR-503的SIM-A9細胞中p-STAT3, STAT3, p-p65 和p65。L. WB檢測加入或不加入miR-503的SIM-A9細胞和人小神經膠質細胞（HMC-3）中PD-L1的表達。M. IHC檢測乳腺癌的顱內轉移瘤中PD-L1和IBA-1的表達。N. 加入或不加miR-503的SIM-A9與來自小鼠脾臟組織的祖T細胞共培養后，CFSE實驗研究T細胞的增殖。

7.氟達拉濱能夠抑制低表達XIST腫瘤細胞的生長。

圖7. 氟達拉濱能夠抑制低表達XIST乳腺癌細胞的生長。

A.在正常表達或下調XIST的MCF7細胞中，通過MTS實驗檢測FAD批準的藥物庫和化學藥物庫（分別包含1250和140個化合物）。B. 用不同濃度的氟達拉濱處理MCF7-shCTRL和MCF7-shXIST細胞進行克隆形成實驗。C. 用不同濃度的氟達拉濱處理差異表達XIST的癌癥細胞系。D. 在正常表達或下調XIST的231BrM細胞中進行克隆形成實驗。E. 通過心臟注射，將MCF7-shXIST細胞注射到裸鼠體內后，進行氟達拉濱不處理或處理后，lVlS檢測腫瘤的生長。F. Kaplan–Meier分析E中顱內轉移瘤和生存之間的關系。G. 用氟達拉濱處理或不處理的小鼠顱內轉移瘤進行HE染色。H. 在顱內轉移瘤中XIST的下游效應。在癌癥細胞中下調XIST能夠促進EMT、通過MSN上調c-Met信號通路、外泌體分泌的miR-503上調。外泌體miR-503能夠激活小神經膠質細胞并啟動M1-M2的極性轉換，這能夠抑制T細胞的活性。